动物组织样本DNA建库全流程指南

动物组织是生命科学研究的核心样本，其基因组 DNA 广泛应用于基础科研与动物临床诊断。伴随精准医学发展，动物组织 DNA 提取与建库的质控标准日趋严格。

相较于植物叶片，动物细胞无细胞壁、干扰杂质少，DNA 提取操作更简便，常规方法便可制备高质量基因组 DNA。但不同动物组织的纤维、脂肪、核酸含量差异显著，需针对性处理；其中 FFPE 组织 DNA 易发生交联与降解，需采用专用提取及建库方案。

本文系统阐述新鲜、冻存、FFPE 等各类动物组织的 DNA 建库全流程，并推荐翌圣生物配套实验产品。

目前主流的磁珠法动物组织 DNA 提取试剂盒，以翌圣生物货号18391产品为例，采用磁珠法核酸纯化原理，以裂解液搭配蛋白酶 K、RNase A 充分裂解动物组织，消化蛋白并去除 RNA 干扰；裂解结合液为 DNA 与表面修饰磁珠的特异性结合提供适配条件，通过磁力分离实现 DNA 富集；再经洗涤液 A、B、C 依次洗脱去除盐离子、杂质与残留蛋白，最后用洗脱液解离磁珠上的 DNA，获得高纯度基因组 DNA，支持手工与自动化提取，适配 PCR、qPCR 等下游实验。

建库是将基因组 DNA 转化为测序文库的过程，核心步骤为片段打断→末端修复→加 A 尾/磷酸化→接头连接→文库扩增；先将基因组DNA随机打断成一定长度片段，再修复片段末端为平末端，3' 端加 A 碱基，5’羟基磷酸化，提高接头连接效率，连接含标签的测序接头，再通过 PCR 富集文库，最终形成适配二代测序平台的测序文库。

新鲜/冻存组织DNA提取流程（以翌圣18391为例）：

2)组织称量：取5~15mg动物组织（肝 / 肺 / 脾≤10mg），放入 1.5mL 离心管。

3)裂解加液：加入200μL 裂解液 + 20μL 蛋白酶 K，充分匀浆。

4)去除 RNA：加入10μL RNase A，涡旋混匀。

5)恒温消化：60℃振荡温浴 30~120min至组织完全消化；无振荡则中途多次涡旋。难消化组织先室温消化 30min 泡软再匀浆。

6)DNA 结合：加600μL 裂解结合液混匀，再加20μL 磁珠悬浮液，振荡 / 涡旋 5~7min。

7)磁分离弃液：离心管置于磁力架，溶液透亮后吸弃上清，勿触碰磁珠。

8)洗涤液 A 清洗：加 700μL 洗涤液 A→涡旋 10s→磁分离→弃废液。

9)洗涤液 B 清洗：加 700μL 洗涤液 B→涡旋 10s→磁分离→弃废液。

10)洗涤液 C 清洗：加 700μL 洗涤液 C→涡旋 10s→磁分离→弃废液。

11)磁珠干燥：瞬时离心甩尽残液，磁力架吸附并吸净残留液体，开盖空气干燥 3~5min。

12)DNA 洗脱：加50~100μL 洗脱液，高速涡旋 2~3min，60℃温浴 5min，再高速涡旋 30s。

13)产物收集：瞬时离心、磁分离，将 DNA 溶液转移至新离心管。

14)样本保存：-20℃短期保存，-80℃长期保存。

15)安全提示：试剂含胍盐，需戴手套操作；废液按医疗废物处理，禁止接触次氯酸钠。

磁珠法提取原理简版示意图

16)FFPE组织DNA提取流程：

1)纯度检测： 使用NanoDrop检测A260/A280和A260/A230比值。

2)浓度检测： 使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行精确定量。Qubit的检测下限为0.1 ng/μL，适合低浓度样本的精确定量⁹。建议DNA浓度控制在20-200 ng/μL。

3)完整性检测： 对于新鲜组织DNA，取200-500 ng进行1%琼脂糖凝胶电泳（120 V，30分钟）或使用Bioanalyzer Genomic DNA Chip检测。

1、DNA建库

1）前期准备：试剂盒组分室温解冻混匀，磁珠室温平衡 30min，现配 80% 乙醇，按测序平台与 DNA 上样量稀释接头； 

2）三合一核心反应：冰上配制反应体系，PCR 仪完成DNA 片段化 + 末端修复 + dA 尾添加一步反应； 

3）接头连接：向三合一产物中加入接头、连接增强剂与快速连接酶，混匀后进行连接反应； 

4）连接产物纯化：加磁珠结合 DNA，磁力架吸附后乙醇漂洗，磁珠干燥后用超纯水洗脱； 

5）（可选）片段分选：按目标插入片段比例，用磁珠做双轮长度分选，获得目标片段； 

6）文库扩增：配制 PCR 扩增体系，按程序对连接产物进行扩增富集； 

7）扩增产物纯化：用 1.0× 磁珠纯化扩增产物，乙醇漂洗、干燥后洗脱得到终文库；

8）文库质检：qPCR 定量有效文库浓度，毛细管电泳检测片段分布。

酶切法建库流程示意图

PCR-free建库方案：此方案省去了PCR扩增步骤，可以避免扩增引入的偏好性和错误，特别适合变异检测、拷贝数分析等对准确性要求高的应用。PCR-free建库需要更高的样本起始量，且接头连接效率需要更高。

FFPE DNA建库方案：专门针对FFPE DNA特点优化：

浓度检测：使用Qubit HS dsDNA试剂定量文库浓度。

上机测序：根据测序平台要求进行文库 pooling 和上机。

样本新鲜度：新鲜组织DNA质量最佳，如需保存，建议液氮速冻后于-80℃保存，避免反复冻融。反复冻融会导致DNA降解和断裂⁴

纤维组织处理：对于肌肉、心肌等纤维含量高的组织，建议在蛋白酶K消化前进行充分的机械破碎（如匀浆），以提高裂解效率³

FFPE组织特殊处理：FFPE样本的DNA质量受固定时间和固定条件影响较大。固定时间过长（>24小时）会导致严重的交联和降解。建议在石蜡块4℃保存，并在2年内完成DNA提取⁵

批次设置：每批次实验应设置阴性对照（空白提取）和阳性对照，监控污染和体系稳定性⁷

起始量选择：标准建库建议起始量100-500 ng；PCR-free建库需要≥1 μg；FFPE建库可接受10-100 ng起始量，但需要优化PCR循环数。