做qPCR实验的朋友，每天都要跟荧光染料打交道。面对SYBR Green、TB Green、EVA Green这些名字，你是否也有过疑惑：它们不都是绿色荧光的DNA结合染料吗？到底有什么区别？今天我们就来把这“三剑客”的底细扒一扒。

SYBR Green I：最经典的“老大哥”

SYBR Green I可以说是qPCR染料法的元老，绝大多数实验室都跟它打过交道。它的原理很简单——游离状态下几乎没有荧光，一旦与双链DNA（dsDNA）结合，荧光信号就会急剧增强，通过检测每个循环的荧光强度，就能实时监控PCR产物的积累。

作为最常用的DNA结合染料，SYBR Green I灵敏度高、价格亲民，对于常规的基因表达分析完全够用。但它有个“硬伤”：对PCR有较强的抑制性。这导致实验中它的使用浓度必须被严格限制在较低水平，浓度稍高就会干扰扩增效率，出现Ct值延迟或非特异性产物。

低浓度带来的另一个问题是“染料重分布”。在熔解曲线分析时，随着温度升高双链逐渐解开，SYBR Green I会从已解离的区域脱落，重新结合到尚未解链的双链区域。这种“打游击”的现象使得熔解曲线分辨率有限，无法精确区分单碱基差异，更别说用于高分辨率熔解曲线（HRM）分析了。

此外，SYBR Green I的稳定性也常被吐槽——多次冻融或高温条件下容易降解，而降解产物对PCR的抑制性更强。安全性方面，SYBR Green I能快速穿透细胞膜，有一定的诱变增强风险。

EVA Green：为突破局限而生的“技术派”

EVA Green的出现，很大程度上就是为了解决SYBR Green I的上述痛点。它的核心技术是“按要求释放”（release-on-demand）DNA结合机制——分子设计上，两个单体染料通过弹性臂连接成二聚体，无DNA存在时呈无荧光的环状结构，结合DNA后恢复随机形态并发出强烈荧光。

这一设计带来了几个关键优势：

首先是对PCR抑制性小。EVA Green允许在较高浓度下使用，不仅能获得比SYBR Green I更强的扩增信号，还能兼容快速PCR程序，极大缩短延伸时间。其次是消除了“染料重分布”缺陷，因为饱和浓度的染料占据了DNA双链上所有可结合位点，熔解曲线分辨率大幅提升，足以区分单碱基差异，非常适合HRM分析和多重PCR。

稳定性也是EVA Green的亮点——在PCR缓冲液中95-100℃加热48小时也不会明显分解，室温下可稳定存放，反复冻融无压力。安全性方面，EVA Green几乎不能穿透细胞膜，Ames测试显示无致突变性和细胞毒性，比SYBR Green I友好得多。

值得一提的是，EVA Green是目前唯一能用于微滴式数字PCR（ddPCR）的染料，在微流控PCR、恒温扩增等前沿领域也有出色表现。

TB Green：是换了马甲还是有真功夫？

说到TB Green，很多人的第一反应是：很熟悉，在常见试剂品牌中有见到，但是一直不明白区别。

从目前公开的技术资料来看，TB Green的光谱特性、DNA结合机制和性能表现与SYBR Green I高度一致，并没有像EVA Green那样的革命性结构创新。可以理解为是不同厂商对同类第一代qPCR染料的商品化命名。

选哪个？

1.常规基因表达分析，选SYBR Green I或TB Green完全够用，只要做好熔解曲线质控，数据一样可靠。

2.追求更高数据质量，或做HRM、多重PCR：直接上EVA Green。它更高的信号强度和更低的背景能让你获得更宽的信噪比窗口，结果更稳健。

3.如果你在搭建ddPCR体系：EVA Green是目前最佳的选择。

染料只是工具，适合你的实验场景才是硬道理。希望这篇文章能帮你下次选试剂时少一点纠结，多一点把握。

对于做常规基因表达分析的，给大家推荐Hieff UNICON® ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix

产品特色

移液追踪：降低漏加/错加风险

扩增优异：在宽广的线性范围内有良好的线性关系

精准度好：可精准区分2倍浓度差异模板

重复性好：复孔孔间差异小，有更好的重复性

稳定可靠：反应体系可于常温放置24小时，产品反复冻融20次不影响

应用案例

• 移液追踪，降低漏加/错加风险

移液追踪，进程清晰。使用产品按照按照说明书进行加样，其中混有不同颜色染料的模板最终投入量均为2 μL。观察显示翌圣新品移液追踪可清晰展示加样进程。

• 扩增优异，动态范围内可获得可靠的结果

动态范围内可获得可靠的结果。以2 µL的101-107梯度的质粒为模板，扩增相关基因。Hieff UNICON® ColorGPS 预混液可有效检测7个数量级范围的模板量，在宽广的线性范围内获得良好的线性关系。

• 可精准分辨2倍模板浓度差异

可精准分辨2倍模板浓度差异。以2 µL的质粒的2倍梯度稀释液为模板，扩增相关基因。Hieff UNICON® ColorGPS 预混液能够精准分辨模板浓度差异。

• 不同类型样本基因扩增出色

扩增不同类型样本基因，多能表现出色。以不同类型样本不同基因为靶标，使用不同荧光定量试剂按照各自说明书规定的程序进行扩增。ΔCT 值 (△CT = CT (各qPCR产品) – CT (11188ES))显示，新品在多数样本基因中扩增更加出色。

• 重复性好

复孔孔间差异小，表现出更好的重复性。以数十个拷贝质粒为模板，使用不同荧光定量试剂按照各自说明书规定的程序进行扩增。SD值表明，相比于其他反转录试剂，新品复孔间差异更小，重复性更好。

• 适用于标准或快速程序

更加灵活，适用于标准或快速程序。标准程序中变性时间和延伸时间分别设置为10秒和30秒，快速程序中变性时间和延伸时间分别设置为3秒和10秒，检测10个目标基因对应的CT值。结果显示，新品在标准和快速程序中得到的CT值相关性强，新品使用快速程序能够获得良好的结果。

• 反应体系可在室温下稳定保持24小时

制备完反应体系后，可在室温下稳定保持24小时。分别以小鼠、人293细胞、拟南芥不同基因作为靶标，制备完反应体系后，在不同温度中避光放置24小时再进行检测。相较于即刻上机，不同基因检测差异不超过0.5个CT，表明长时间操作也可获得稳定结果。

• 储存稳定可靠

试剂于不同温度放置7或14天，仍能够保持较好的稳定性。新品分别在25℃放置14天和在37℃放置7天。以不同样本不同基因作为靶标进行扩增检测。数据显示，试剂储存稳定性好，得到的CT值相差不大，不超过0.5个CT。

试剂反复冻融多次，仍能够保持较好的稳定性。将新品冻融20次后，分别以小鼠、人、拟南芥不同基因作为靶标进行qPCR。ΔCT 值显示，试剂反复冻融后，得到的CT值相差不大，不超过0.5个CT。