逆转录实验需要模板，引物，逆转录酶，Rnase抑制剂等组分的参与，但是引物的选择上，每个做过这个实验的伙伴都曾纠结过引物如何选，选择哪种反转录引物，直接决定了你能逆转录出什么样的 cDNA，以及后续实验的成败。今天我们就来统一看看引物选择的问题，到底是怎么个回事儿

引物选择核心思路

1. Oligo dT：只抓有“尾巴”的

 

原理：由一串 T（通常 15-18 个 T）组成，与真核生物 mRNA 的 3‘端 poly(A) 尾结合。

优点：

特异性高：主要反转录 mRNA（占总 RNA 的 1-5%），背景噪音低。

全长性好：从 3’端起始，容易获得靠近 5‘端的全长序列（前提是逆转录酶能力够强）。

缺点：

对降解敏感：如果 RNA 降解了，或者 poly(A) 尾被破坏，5’端序列会丢失，导致 qPCR 结果偏差（3‘端信号强，5’端信号弱）。

受二级结构影响：如果 mRNA 3‘端附近有复杂二级结构，逆转录酶可能在此处脱落。

适用场景：

真核生物 mRNA 定量（qPCR），特别是检测基因表达差异。

RNA-Seq 文库构建（通常结合随机引物或打断后使用）。

不适用于：原核生物 RNA（大部分无 polyA）、rRNA/tRNA 或某些非编码 RNA。

 

2. Random Primers：逮谁算谁

 

 

原理：

通常是 6 个碱基的随机混合物（Random Hexamers），理论上能与任何 RNA 序列随机匹配结合。

优点：

无偏好性：能反转录所有的 RNA（mRNA, rRNA, tRNA, ncRNA），产量最高。

克服二级结构：因为是从多个随机点起始，可以绕过 RNA 的复杂二级结构区域。

降解模板首选：即使 RNA 已部分降解，随机引物依然能获得较均一的 cDNA。

缺点：

背景高：会大量反转录 rRNA（占总 RNA 80%以上），在定量低丰度 mRNA 时，可能会稀释特异性信号或消耗引物/酶资源。

不利于全长：产生的 cDNA 偏向于 5‘端或随机区域，不利于获得 3’端完整序列。

适用场景：

检测非编码 RNA（如 lncRNA, miRNA 需要特殊加尾法）。

短片段基因扩增。

RNA 质量不佳或富含 GC、二级结构复杂的区域。

双链 cDNA 合成（某些文库构建）。

 

3. GSP (Gene Specific Primers)：精准结合

 

 

原理：

针对你感兴趣的特定基因设计的一条反向引物，只反转录那一个基因。

优点：

灵敏度最高：把所有逆转录酶的精力都集中在目标基因上，特别适合检测极低丰度的转录本。

背景最低：只有目标基因被反转录，无其他背景干扰。

缺点：

不灵活：一份 cDNA 只能用于检测一个基因。如果你要检测 10 个基因，需要做 10 次反转录。

难保存：这种 cDNA 不能用于检测其他基因（比如内参基因），除非在反转录后再混合其他引物，但操作繁琐。

适用场景：

Northern Blot探针合成。

3‘/5’ RACE（cDNA 末端快速扩增）。

检测某些表达量极低的特定转录本（如某些病毒 RNA）。

 

总结

根据实验目的不同，可按下列建议选择

a）对于全长第一链cDNA合成，且模板为真核生物来源，推荐选择Oligo (dT)引物。

b）当目标区域具有复杂二级结构或模板为原核生物来源，推荐选择Random Primers引物。

c）基因特异性引物（GSP）是与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。

d）若逆转录后续为qPCR实验，可将Oligo (dT)与Random Primers混合使用

  

Q：若实验过程中场景居多，既做非编码RNA的逆转录，又做mRNA的逆转录，且下游都做qPCR的，应该购买哪种试剂盒呢？现在很多试剂盒中都是Oligo (dT)引物与Random Primers引物预混了的。

A：这种可以选择我们的11149ES Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit，产品中的Oligo (dT)引物与Random Primers引物分开为2个独立组分，可以根据需求选择不同的引物搭配，亦可使用自己合成的GSP呢！

产品特色

示踪便利：蓝色示踪，提醒客户加样进度

下游适用应用：可用于下游PCR或qPCR

逆转录时间：反转录时间仅需5分钟

检出率：10 pg-1 ug 的RNA检出率

逆转录效率：逆转录效率媲美竞品，最长可合成14kb大小的片段

试剂盒稳定性：4°C存放14天

反转录产物稳定性：37°C保存7天，反复冻融50次

  

产品数据

• 快速反转

图. 以293T细胞总RNA为模板，使用11149ES进行逆转录，得到的cDNA 进行qPCR 定量分析。

结果显示：不同反转录时间处理的Ct值差值在0.2之内。说明产品可在5分钟内完成反转录，反转效果和长时间反转效果持平。

 

• 灵敏度高，最低可至10 pg

 

图. 以293T细胞总RNA为模板，使用11149ES进行逆转录，得到的cDNA 进行qPCR 定量分析。

结果显示：RNA 投入量为10 pg-1 μg时，11149ES均可反转成功，保证定量结果。

 

• 扩增性能好，最长扩增14 kb片段

 

图. 以293T细胞总RNA为模板，使用11149ES进行反转录，将得到的cDNA进行PCR检测。

结果显示：11149ES能够满足合成1 kb-14 kb长度的cDNA, 后续PCR有一定的试用场景。若需要直接反转出10kb以上的片段，建议延长反转录时间至20-30分钟，以保证最终片段的获取。

 

• 示踪便利

 

图. 测试显示，加入一定量的示踪剂成分，未影响产品的反转录效率，Ct值、熔解曲线峰值和TM值未受到负面影响。