T细胞是免疫系统的核心，在抗感染、抗肿瘤中起关键作用。小鼠脾脏T细胞因与人类免疫特性相似，成为研究T细胞功能、免疫机制及开发免疫治疗（如CAR-T）的重要模型。本方案解决了体外活化扩增效率低、细胞状态差等问题，为相关科研提供标准化技术支撑。

小鼠脾脏是机体重要的外周免疫器官，富含T淋巴细胞（约占脾脏淋巴细胞总数的40%-50%），包括CD4⁺辅助性T细胞、CD8⁺细胞毒性T细胞等亚群。本方案通过机械分离获得脾脏单细胞悬液，经免疫磁珠分选富集T细胞后，利用抗CD3/CD28单克隆抗体提供特异性激活信号，结合细胞因子（如IL-2）维持细胞增殖活性，实现T细胞的体外高效扩增。扩增过程中严格控制培养条件，避免杂细胞污染及T细胞功能耗竭，确保扩增后细胞的纯度、活性及免疫功能稳定性。

6-8周龄C57BL/6或BALB/c小鼠（根据实验需求选择品系），由正规动物实验中心提供，饲养于SPF级动物房。

1)基础培养基：RPMI-1640培养基（含L-谷氨酰胺、25 mM HEPES），添加10%胎牛血清（FBS，经热灭活处理）、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素，过滤除菌后4℃储存，使用前平衡至室温。
2)细胞分选试剂：抗体偶联磁珠。
3)激活试剂：抗小鼠CD3ε单克隆抗体、抗小鼠CD28单克隆抗体。
4)细胞因子：重组小鼠IL-2，冻存于-80℃，使用前用基础培养基稀释。
5)辅助试剂：红细胞裂解液（ACK Lysing Buffer）、PBS缓冲液（pH7.4）、0.25%胰酶-EDTA溶液、台盼蓝染色液（0.4%）、流式抗体（CD3-PE、CD4-FITC、CD8-APC，用于纯度鉴定）。

超净工作台、CO₂培养箱（5% CO₂，37℃，饱和湿度）、离心机、流式细胞仪、倒置显微镜、细胞计数板、无菌离心管（15 mL/50 mL）、无菌培养瓶（25 cm²/75 cm²）、无菌研磨棒、200目细胞筛网、磁珠分选柱、磁力架、移液器及无菌吸头。

1)小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡3-5 min。
2)小鼠仰卧位固定，剪开腹部皮肤及腹膜，暴露脾脏，用镊子取出脾脏放入含5 mL预冷PBS的培养皿中，去除表面结缔组织及脂肪。

1)用无菌研磨棒轻轻研磨脾脏，通过200目细胞筛网过滤至15 mL离心管中，用PBS反复冲洗筛网，收集过滤后的细胞悬液，避免用力研磨导致细胞破裂。

2)1500 rpm离心5 min（4℃），弃上清，加入3 mL ACK红细胞裂解液，室温孵育3-5 min，期间轻轻颠倒离心管2-3次，充分裂解红细胞。

3)加入10 mL预冷PBS终止裂解，1500 rpm离心5 min（4℃），弃上清，用PBS洗涤细胞2次（每次1500 rpm离心5 min），去除残留裂解液及细胞碎片。

4)末次离心后，弃上清，加入5 mL基础培养基重悬细胞，取少量细胞悬液用台盼蓝染色，细胞计数板计数活细胞数量（活细胞率需≥ 90%），剩余细胞用于后续分选。

1)细胞计数：将缓冲液重悬细胞，调整浓度至1×10⁷~1×10⁸ cells/mL。
2)磁珠孵育：按试剂说明书比例加入CD3抗体磁珠（通常10 μL磁珠/1×10⁷个细胞），室温避光孵育15~20分钟，期间轻轻颠倒离心管2~3次。
3)磁场分离：将离心管放入磁力架，室温静置5分钟，吸弃上清（未结合磁珠的细胞），加入基础缓冲液洗涤2次，每次静置3分钟后弃上清。
4)洗脱目标细胞：取出离心管，脱离磁力架，加入适量基础缓冲液，轻轻吹打重悬细胞，收集液体即为CD3+ T细胞。
5)纯度验证：取少量分选后细胞，加入CD3荧光抗体染色，流式细胞仪检测，确保纯度≥ 90%。

1)包被培养板：使用前一日，用适量抗CD3ε抗体溶液（常用浓度1-5 μg/mL，溶于PBS）包被细胞培养板（如6孔板），4℃过夜或37℃孵育2小时。孵育后吸弃包被液，用PBS洗涤一次以去除未结合的抗体。
2)接种与刺激：将调整好浓度的脾脏单细胞悬液，通常以1-2 × 10⁶ cells/mL的密度接种至已包被抗CD3ε抗体的培养板中。
3)添加刺激因子：向培养基中加入可溶性抗CD28抗体（常用浓度1-2 μg/mL）和重组小鼠IL-2（推荐起始浓度20-50 U/mL）。轻轻混匀后，置于37℃、5% CO₂饱和湿度的培养箱中培养。

1)观察与换液：活化后24-48小时，可见细胞聚集成团，体积增大，此为活化成功的标志。通常在培养48-72小时后进行半量或全量换液。
2)补充营养与因子：换液时，小心吸去一半旧培养基，加入等体积新鲜的、含有IL-2（50-100 U/mL）的完全培养基。此后，根据细胞密度和培养基颜色变化（如变黄），每2-3天进行换液或传代，始终保持细胞密度在0.5 - 2 × 10⁶ cells/mL之间，避免过度拥挤导致细胞凋亡。
3）扩增周期：在持续刺激下，T细胞通常可扩增5-10天，细胞数量可增加数十至数百倍。

1)活性鉴定：台盼蓝染色计数，活细胞率需≥ 85%。
2)纯度鉴定：流式细胞仪检测CD3⁺ T细胞比例，以及CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞亚群分布。
3)功能鉴定：可通过ELISPOT检测细胞因子（IFN-γ、IL-2）分泌能力，或通过细胞毒性实验（如LDH释放法）检测CD8⁺ T细胞对靶细胞的杀伤活性，验证扩增后T细胞的免疫功能。

• 抗体浓度优化：抗CD3/CD28抗体浓度过高易导致T细胞过度激活而耗竭，过低则激活不足，建议通过预实验设置浓度梯度（CD3：2、5、10 μg/mL；CD28：1、2、5 μg/mL），筛选最佳激活浓度。

• IL-2浓度调节：IL-2是T细胞增殖的关键细胞因子，浓度过低会导致增殖缓慢，过高可能诱导调节性T细胞（Treg）增殖，建议根据实验需求调整浓度（10-50 U/mL），若需富集效应T细胞，可选择30-50 U/mL。

• 细胞接种密度：初始接种密度过低会影响细胞间相互作用，导致激活效率下降；过高则易造成营养匮乏及代谢废物积累，建议初始密度控制在1×10⁶ cells/mL，扩增过程中维持在5×10⁵-1×10⁶ cells/mL。

• 培养环境控制：CO₂浓度需严格维持在5%，湿度饱和，避免温度波动（37 ± 0.5℃）；培养基需新鲜配制，FBS需选择批号稳定、无支原体污染的产品，减少杂细胞污染风险。

1.实验全程需遵循无菌操作规范，所有器材及试剂均需灭菌处理，超净工作台使用前紫外线照射30 min，避免细菌、真菌污染。
2.脾脏取材及细胞分离过程需快速，细胞始终保持在冰浴或4℃环境中，减少细胞活性损失；研磨时力度适中，避免机械损伤导致细胞破裂。
3.磁珠分选过程中，分选缓冲液需现配现用，避免EDTA析出影响分选效果；分选柱需保持湿润，避免柱床干涸。
4.扩增过程中需定期观察细胞状态，若出现细胞聚集过多、培养基浑浊或有异味，可能为污染，需及时丢弃污染样本，排查污染源。
5.扩增后的T细胞需尽快用于实验，若需短期保存，可置于4℃冰箱保存24 h，或加入含10% DMSO的冻存液中，-80℃梯度冻存，避免长期常温放置导致功能下降。

重组蛋白已广泛应用于干细胞与类器官培养、重组蛋白药物、CAR-T细胞治疗及抗体药物等核心领域。伴随生物药行业高速发展，重组蛋白市场增长迅猛，高端原料需求逐年攀升。为精准匹配科研与工业场景下持续升级的应用需求，针对重组蛋白活性偏低、批次稳定性不足等关键痛点，翌圣生物依托多年研发生产经验与技术积累，构建了创新型重组蛋白表达及纯化平台，聚焦提供高活性重组蛋白产品。依托于自身蛋白表达与纯化平台，翌圣生物开发了一系列用于小鼠脾脏T细胞培养的IL-2、IL-7、IL-15等HiActi^®细胞因子，经过严格的质量控制及细胞功能的验证，确保产品具有高活性、高纯度、高稳定性、低内毒素水平，助您拿到理想的实验结果。

小鼠脾脏T细胞培养常用细胞因子

Bioactivity of Mouse IL-2

图1. Measured in a cell proliferation assay using CTLL-2 mouse cytotoxic T cells. The EC₅₀ for this effect is 0.01-0.1 ng/mL.

Bioactivity of Mouse IL-7

图2. Measured in a cell proliferation assay using PHA-activated human peripheral blood lymphocytes (PBL). The EC₅₀ for this effect is 0.01-0.2 ng/mL.

Bioactivity of Mouse IL-12

图3. Measured in a cell proliferation assay using PHA-activated mouse splenocytes. The EC₅₀ for this effect is 0.5-4 pg/mL.