高效扩增与功能维持：人外周来源T细胞体外培养指南
免疫细胞的来源和分类
免疫细胞的来源
免疫细胞均起源于骨髓中的造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells，HSCs）。造血干细胞具备自我更新能力和多向分化潜能，可通过“髓系分化”和“淋巴系分化”两大路径，逐步分化为所有类型的免疫细胞，最终分布到外周免疫器官（如淋巴结、脾脏、黏膜相关淋巴组织）或外周血中，执行免疫功能。
免疫细胞的分类
免疫细胞是人体免疫系统的核心组成部分，主要分为先天性免疫细胞（固有免疫细胞）和适应性免疫细胞两大类。两类细胞功能互补，前者负责快速响应病原体入侵，后者负责精准识别并长期记忆特定病原体，共同构成人体的免疫防御体系。
图1.免疫细胞的分类
T细胞
T细胞的概念
T淋巴细胞，简称T细胞，是人体适应性免疫系统的核心细胞，属于白细胞的一种，因需在胸腺（Thymus，“T”即源于此）中分化成熟而得名。它起源于骨髓造血干细胞，成熟后分布在血液、淋巴结、脾脏等外周免疫器官，主要通过表面的“T细胞抗原受体（TCR）”精准识别病原体（如病毒、细菌）或异常细胞（如癌细胞）。
T细胞的分类
T细胞的分类核心依据功能、表面标志物、活化状态等维度，不同亚群在免疫应答中分工明确，共同构成精准的免疫防御与调控网络，主要分类如下：
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CD8⁺ T细胞：直接杀伤受感染细胞和癌细胞的“杀手”。
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CD4⁺T细胞：通过分泌信号分子来协调其他免疫细胞行动的“指挥官”。
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初始T细胞（Naive T cells）：未接触过特异性抗原，长期存在于外周免疫器官，表面表达CD45RA，接触抗原后需双重信号激活，启动“初次免疫应答”（反应慢、强度弱）。
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效应T细胞（Effector T cells）：当初始T细胞被抗原激活后，会大量增殖并分化为效应T细胞，它们离开淋巴器官，迁移到感染部位去直接执行清除病原体的任务。
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记忆T细胞（Memory T cells）：初次免疫应答后留存的T细胞，表面表达CD45RO，可长期存活；再次接触相同抗原时，能快速活化、增殖为效应细胞，启动“二次免疫应答”（反应快、强度强），是疫苗长期保护的核心机制。
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αβ T细胞：占外周血T细胞的90%-95%，TCR由α、β链组成，需依赖MHC分子识别抗原，是适应性免疫核心，应对感染和肿瘤。
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γδ T细胞：仅占5%-10%，TCR由γ、δ链组成，不依赖MHC，直接识别抗原，多在黏膜组织，快速响应感染和肿瘤，兼具固有免疫特性。
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辅助性T细胞（Th）：不直接杀伤，通过分泌不同细胞因子（如IFN-γ、IL-4），辅助激活B细胞、增强杀伤细胞功能，调控细胞免疫和体液免疫。
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细胞毒性T细胞（CTL）：直接杀伤靶细胞，通过释放穿孔素、颗粒酶或Fas/FasL途径，清除病毒感染细胞和癌细胞。
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调节性T细胞（Treg）：抑制过度免疫，分泌IL-10、TGF-β等，防止免疫攻击自身组织，预防自身免疫病。
图2. T细胞各亚群分型[1]
T细胞的作用机制
T细胞作用流程可简化为“识别→活化→执行→记忆”4步，核心逻辑是精准识别目标后，通过分工清除病原体并留存长期保护能力。
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抗原呈递细胞（APC）吞噬处理病原体，将其分解为抗原肽，再结合自身MHC分子，形成“抗原肽-MHC复合物”并展示在表面。
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T细胞通过表面TCR特异性结合该复合物，同时CD4/CD8分子匹配APC的MHCⅡ/Ⅰ类分子，完成抗原识别。
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需双重信号激活：一是TCR结合复合物（确保特异性），二是APC的B7分子结合T细胞的CD28。
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激活后，T细胞在IL-2等细胞因子作用下增殖，分化为大量效应T细胞和少量记忆T细胞。
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细胞毒性T细胞（CTL）：释放穿孔素、颗粒酶，或通过Fas/FasL途径，直接杀伤感染细胞、癌细胞。
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辅助性T细胞（Th）：分泌细胞因子，如Th1增强巨噬细胞吞噬、Th2促进B细胞产抗体，调控免疫应答。
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调节性T细胞（Treg）：分泌IL-10、TGF-β，抑制过度免疫，避免损伤自身组织。
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多数效应T细胞完成任务后凋亡，少数分化为记忆T细胞，长期存活且保留抗原识别能力。
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相同抗原再次入侵时，记忆T细胞可快速分化为效应T细胞，启动更强更快的二次免疫应答，这是疫苗保护的核心。
T细胞在疾病中的作用
T细胞在感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤、移植排斥反应四类核心疾病中作用有关键的作用。感染性疾病里，其可通过CTL杀伤病毒感染细胞、辅助调控清除细菌；自身免疫性疾病因T细胞亚群失衡，引发免疫系统攻击自身组织；肿瘤中，CTL能杀肿瘤细胞却易被微环境抑制，可通过CAR-T、TIL等疗法改造激活T细胞来治疗；移植排斥反应中，T细胞会攻击移植物，监测其数量功能可早发现排斥反应、指导调整免疫抑制剂以提升移植成功率。
T细胞是我们抵御感染的勇士、对抗肿瘤的哨兵，但一旦失控，也会成为攻击自身的叛军或造成毁灭性炎症的暴徒。现代医学正致力于“扬其长、避其短”，通过调节T细胞的功能来治疗各种疾病。
图3. γδ T细胞的抗肿瘤和促肿瘤免疫作用[2]
外周来源T细胞
什么是外周来源T细胞
外周来源T细胞是指成熟T细胞离开胸腺后，在外周免疫器官和组织中定居、增殖和分化而来的T细胞群体。
外周来源T细胞根据表面受体和功能的不同，可细分为多种亚型，如辅助性T细胞（Th1、Th2、Th17等）、细胞毒性T细胞（CTL）以及调节性T细胞（Treg）等。这些不同亚型的T细胞各司其职，协同作用，共同维护机体内环境的稳定，在免疫防御、免疫监视和免疫自稳等过程中发挥着关键作用。
人外周来源T细胞的培养
人外周来源T细胞的培养指的是在体外条件下，模拟体内环境，使从外周免疫组织/体液中分离出的T细胞存活、增殖并可能分化为特定功能亚群的技术。具体流程如下：
1）来源：外周静脉血（最便捷，临床常用）、脐带血、外周淋巴结或脾脏组织（需手术获取，较少用）。
2）分离外周血单个核细胞（PBMCs）：使用密度梯度离心法（常用Ficoll试剂），将全血中的红细胞、粒细胞等与密度较轻的单核细胞（包括淋巴细胞）分离开。
3）T细胞富集：用免疫磁珠分选法（MACS）或流式细胞术分选，通过识别T细胞表面特异性标志物（如CD3），去除B细胞、单核细胞等杂质，富集高纯度T细胞。
T细胞需“双信号+细胞因子”刺激才能活化，模拟体内抗原识别和协同激活过程，常用刺激体系如下：
1)第一信号（抗原模拟）：用抗人CD3单克隆抗体（如OKT3）包被培养板，或结合磁珠，模拟TCR与抗原肽-MHC复合物的结合，触发T细胞初步激活。
2)第二信号（协同刺激）：加入抗人CD28单克隆抗体，模拟APC表面B7分子与T细胞CD28的结合，确保T细胞完全活化。
3)细胞因子（增殖支持）：添加IL-2（核心细胞因子，促进T细胞增殖）、IL-7/IL-15（维持T细胞存活、减少凋亡），部分场景会加IL-12（诱导Th1分化）或IL-4（诱导Th2分化），调控T细胞亚型。
1）培养条件：
培养基：RPMI1640或DMEM，添加10%胎牛血清（FBS）或人血清，以及青霉素/链霉素。
环境：37°C，5% CO₂的细胞培养箱。
2）维持培养：
每2-3天观察细胞密度和状态。
进行半量换液：吸走一半旧培养基，补充等量的新鲜培养基和细胞因子。
监测细胞密度（维持1×10⁶-2×10⁶ cells/mL），避免密度过高导致营养不足或凋亡。
培养一段时间后（通常5-14天），可以对细胞进行分析：
1）表型分析：
通过流式细胞术检测细胞表面标志（如CD4，CD8）和胞内细胞因子。
2）功能分析：
增殖能力：CFSE染色示踪增殖。
细胞毒性：检测CD8⁺ T细胞杀伤靶细胞的能力。
细胞因子分泌：ELISPOT或流式细胞内染色检测IFN-γ，IL-4等。
人外周来源T细胞培养常用细胞因子
在外周来源T细胞（如外周血T细胞）的体外培养中，细胞因子是调控T细胞存活、活化、增殖、分化及功能维持的核心信号分子，其作用贯穿从“静息态T细胞激活”到“大规模扩增”再到“功能表型维持”的全过程。不同细胞因子通过特异性结合T细胞表面受体，启动下游信号通路，实现对T细胞生物学行为的精准调控。
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细胞因子 |
核心功能 |
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IL-2 （白细胞介素-2） |
-T细胞核心增殖因子：激活T细胞内JAK-STAT通路，促进细胞周期进展； -维持T细胞存活，抑制活化诱导凋亡； -增强细胞毒性T细胞（CTL）和NK细胞的杀伤活性。 |
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IL-7 （白细胞介素-7） |
-维持T细胞稳态与存活：减少T细胞在长期培养中的凋亡； -促进记忆性T细胞生成，避免终末耗竭； -对初始T细胞增殖更友好。 |
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IL-15 （白细胞介素-15） |
-类似IL-2的增殖作用，但更偏向细胞毒性T细胞（CD8⁺ T）和NK细胞； -诱导T细胞向“效应记忆型”（TEM）分化，增强其抗肿瘤杀伤活性； -不依赖IL-2受体α链（CD25），可激活CD25低表达的T细胞。 |
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IL-12 （白细胞介素-12） |
-诱导T细胞向Th1亚型分化（分泌IFN-γ），增强细胞免疫应答； -显著提升T细胞和NK细胞的IFN-γ分泌量，强化抗肿瘤/抗病毒活性； -抑制Th2亚型分化（避免体液免疫偏向）。 |
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IL-21 （白细胞介素-21） |
-促进T细胞增殖，尤其增强滤泡辅助T细胞（Tfh）分化； -强化CTL和NK细胞的杀伤活性，诱导其表达穿孔素、颗粒酶； -抑制Treg细胞（调节性T细胞）增殖，减少免疫抑制。 |
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图5. The ED50 as determined by a cell proliferation assay using PHA-activated human peripheral blood lymphocytes (PBL) is less than 1 ng/mL, corresponding to a specific activity of > 1 × 106 IU/mg.
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图6. The ED50 as determined by a cell proliferation assay using murine CTLL-2 cells is less than 0.5 ng/mL, corresponding to a specific activity of > 2.0 × 106 IU/mg.
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参考文献
1. Maecker HT, McCoy JP, Nussenblatt R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews Immunology 2012; 12(3):191-200.
2. Sun L, Su Y, Jiao A, Wang X, Zhang B. T cells in health and disease. Signal Transduction and Targeted Therapy 2023; 8(1).
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