逆转录实验经典灵魂拷问：到底要不要去除基因组DNA？
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2026-07-07
宝子们平时购买逆转录试剂盒的时候是不是销售都会问这么一个问题：咱们要不要去除基因组呢？这个时候你是不是也会开始思索到底要不要呢？好像以前购买的都是要去除的，那为啥要去除，不去除会咋样呢？今天咱们就从头到尾梳理一下
基因组DNA（gDNA）是生物体遗传信息的完整载体，包含所有编码和非编码序列。
1.物理共沉淀：在RNA提取过程中（如TRIzol法、柱离心法），虽然设计上倾向于分离RNA，但裂解细胞释放出的长链基因组DNA分子非常粘稠，容易在离心或过柱时物理性地混入沉淀或残留于柱子上，最后被洗脱下来。
2.操作引入的污染：吸取上清时，如果不小心吸到了中间相或有机相下方的DNA层，或者匀浆过度导致DNA断裂成小片段，这些小片段更容易穿过分离介质进入最终的RNA样本中。
灵魂拷问：到底要不要去gDNA？
首先明确的是：在逆转录后做qPCR时，强烈建议去除基因组DNA（gDNA）污染！这是确保实验结果准确的关键步骤，否则可能产生假阳性或数据偏差。
情况1：不去除gDNA可能会导致哪些问题？
1. 假阳性信号：
若RNA样品中残留gDNA，PCR引物可能扩增出内含子或基因间区（尤其当引物跨外显子设计不合理时）。
结果：目标基因“假表达”，明明没转录，却检测出信号！
2. 定量失真
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对照组 |
操作 |
结果判读 |
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NRC对照组 |
RNA+PCR/qPCR试剂（不加逆转录酶） |
扩出条带/有扩增曲线表面与gDNA污染 |
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NTC（空白对照） |
只加水+PCR/qPCR试剂 |
应无扩增）排除试剂污染） |
做个对照实验就知道！
划重点：NRC没有Ct值是最理想的，若有Ct值的话至少要跟加入cDNA模板体系的Ct值相差5以上。如果Ct值差异大于5个循环，可以认为基因组DNA对检测结果的影响可以忽略不计，实验结果是可靠的。
去除gDNA的方案
方案1：DNase I 消化
优势：成本低，效果好（彻底降解gDNA）
➊ 切记高温灭活DNase I！否则会降解后续cDNA
➋ 灭活后建议纯化RNA，避免EDTA抑制逆转录酶活性 。
方案2：使用含有基因组DNA去除的逆转录试剂
优势：无需纯化，反转录的同时也能进行基因组DNA的去除。
方案3：设计跨内含子的引物
原理：跨内含子设计意味着引物的一部分位于一个外显子上，而另一部分位于另一个外显子上，两者之间隔着一个或多个内含子。由于真核生物的基因组DNA中含有内含子，而在mRNA中内含子已经被剪切掉，因此如果引物设计跨过内含子，在进行PCR扩增时，只有反转录得到的cDNA（不含内含子）能够被有效扩增，而基因组DNA（含内含子）则无法被有效扩增，从而减少了基因组DNA污染带来的干扰。
情况2：可以不去（但有前提）
仅做定性/半定量，不需要精确定量的实验
以上方法中，最方便的还是使用带有去除基因组DNA的逆转录试剂盒啦~
推荐咱们的11155ESHifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (DNA digester plus)
基因组DNA去除效率高
|
检测对象 |
产品 |
CT(未消化) |
CT(消化) |
清除效率 |
|
基因a |
11155ES |
18.69 |
33.48 |
99.99% |
|
产品A |
33.38 |
99.99% |
||
|
产品B |
34.51 |
99.99% |
||
|
产品C |
26.75 |
99.62% |
||
|
产品D |
32.63 |
99.99% |
||
|
基因b |
11155ES |
19.71 |
27.99 |
99.68% |
|
产品A |
28.29 |
99.74% |
||
|
产品B |
28.83 |
99.82% |
||
|
产品C |
21.56 |
72.21% |
||
|
产品D |
28.33 |
99.75% |
能有效消化去除gDNA。以1000 ng人293T细胞DNA为模板，使用不同反转录试剂按照各自说明书规定的程序进行消化和反转录，同时设置不进行gDNA消化的实验组。后续使用染料法qPCR进行qPCR。数据显示，试剂可对gDNA进行有效消化。
可根据需求灵活选择是否需要去除基因组DNA，产品选择不再纠结！
11155中包含去除基因组DNA组分，针对各自实验场景，可以选择加入该组分或者不加该组分！
- 若实验需要去除残留DNA
1. DNA消化
在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。37℃孵育2min。
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组分 |
使用量 |
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DNA Digester Mix -V2 |
2 μL |
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Total RNA |
10 pg -2 μg* |
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or mRNA |
10 pg-500 ng |
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RNase-free H2O |
补水至 14 μL |
* 建议Total RNA的投入量不超过2 μg。如果目的基因的表达丰度低，可增加投入量至最多5 μg Total RNA。
2. 反转录反应体系配制（20 μL体系）
- 若实验无需去除残留 DNA
1. 反转录反应体系配制（20 μL 体系）
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组分 |
使用量 |
|
Hifair® AdvanceFast SuperMix |
6 μL |
|
Total RNA |
10 pg -2 μg* |
|
or mRNA |
10 pg-500 ng |
|
RNase-free H2O |
补水至 20 μL |
* 建议 Total RNA 的投入量不超过 2 μg。如果目的基因的表达丰度低，可增加投入量至最多 5 μg Total RN
