作为一名技术支持，经常收到客户的咨询：“我想检测这个lncRNA，该用什么反转录引物？”“miRNA的反转录试剂怎么选？”“circRNA为什么用Oligo dT做不出来？”今天，我们就从实验操作的角度，系统讲解各类常见非编码RNA的反转录原理、实验要点，并推荐相应的试剂选择方案。

 一、非编码RNA反转录的核心挑战

非编码RNA种类繁多，包括长链非编码RNA（lncRNA）、微小RNA（miRNA）、环状RNA（circRNA）、转运RNA（tRNA）等。与mRNA相比，这些RNA在反转录实验中面临几个共同挑战：

• 丰度低：多数非编码RNA表达水平远低于mRNA
• 结构复杂：tRNA、rRNA等具有高度二级结构，普通反转录酶难以通读
• 缺乏poly(A)尾：除部分lncRNA外，多数ncRNA没有poly(A)尾，无法使用Oligo dT引物

因此，针对不同类型的非编码RNA，我们需要“因材施教”，选择合适的反转录策略。

二、各类非编码RNA的反转录实验方案

1. lncRNA的反转录

技术难点：lncRNA长度>200 nt，GC含量差异大，二级结构复杂，且丰度相对较低 。

引物选择策略：

随机引物（Random Primers）：最常用，可覆盖lncRNA全长，避免3′端偏好性

混合引物（Oligo dT + Random）：对于带poly(A)尾的lncRNA，可使用混合引物兼顾全长覆盖和5′端完整性

实验操作要点 ：

1. RNA提取后DNase I消化：lncRNA与基因组DNA长度相似，易受gDNA污染干扰，必须彻底去除

2. 模板变性：65℃孵育5 min，冰上急冷，打开二级结构

3. 反转录温度：对于高GC或复杂结构，可将反应温度提高至50-55℃

试剂推荐：翌圣生物 cDNA第一链合成试剂盒11149——该试剂盒包含gDNA Digester Mix，可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染，保证后续结果更加可靠。该试剂盒提供两种cDNA合成引物：Random Primers N6和Oligo (dT)18，用户可根据需要，选择Random Primers N6，Oligo (dT)18或Gene Specific Primers作为逆转录引物，合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR或者qPCR反应。

2. circRNA的反转录

技术难点：circRNA为闭合环状结构，无poly(A)尾，且与线性RNA同源序列共存，需要特异性引物或者随机引物反转录。

实验操作要点 ：

1. RNA提取质量至关重要：研究对比发现，柱式法提取的RNA纯度优于Trizol法，更有利于后续circRNA检测

2. 反转录使用随机引物（Random hexamers），浓度适中（避免过高浓度导致cDNA过短）

3. 后续qPCR引物需跨反向剪接位点设计，确保特异性检测circRNA而非同源线性RNA

试剂推荐：翌圣生物 cDNA第一链合成试剂盒11149——该试剂盒包含gDNA Digester Mix，可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染，保证后续结果更加可靠。该试剂盒提供两种cDNA合成引物：Random Primers N6和Oligo (dT)18，用户可根据需要，选择Random Primers N6，Oligo (dT)18或Gene Specific Primers作为逆转录引物，合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR或者qPCR反应。

3. miRNA的反转录

技术难点：miRNA长度仅约22 nt，无法使用常规引物，且家族成员序列相似性高，需要高特异性区分 。

两大主流方法：

（1）茎环法（Stem-loop RT-PCR）

原理：使用设计的茎环引物与miRNA 3′端部分序列结合，反转录后获得较长cDNA，再进行qPCR

优点：特异性极高，可区分单个碱基差异的家族成员

操作要点：每个miRNA需要设计特异性茎环引物，多重检测时需多个反转录反应

（2）加poly(A)尾法

原理：先使用poly(A)聚合酶在miRNA 3′端加上poly(A)尾，再用Oligo dT-接头引物进行反转录

优点：一个反转录反应可覆盖所有miRNA，适合全景 profiling

操作要点：加尾反应和反转录反应可在一管中连续进行，避免开管污染

试剂推荐：

无论您偏好哪种方法，都能获得高灵敏度、高特异性的miRNA检测结果 。

11170产品特色

· 灵敏度高：可达10pg

图.以小鼠肝脏细胞的Total RNA为模板，用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)

（Cat# 11139ES）进行反转录，获得的cDNA 以10倍梯度稀释（范围10pg /μL-0.1μg /μL），扩增鼠源的mmu-miR-125a、mmu-miR-132、mmu-miR-351基因。

· 特异性高：能区分同家族miRNA间单碱基差异

图. 人类hsa-let-7家族拥有多条miRNA，彼此间相差的碱基很少，甚至只有单碱基的差异。

以不同的引物，使用 Hieff® miRNA Universal  qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）分别扩增这些miRNA，利用公式2^-△ct x 100%计算匹配率。

· 重复性好：90孔复孔数据显示孔间误差小

图.以人293T细胞的Total RNA为模板反转录，用Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)（Cat# 11139ES）

进行反转录，获得的cDNA稀释50倍，使用Hieff® miRNA Universal  qPCR SYBR Master Mix（Cat# 11170ES）进行90孔平行重复实验扩增人源的hsa-let-7a基因。

· 稳定性好：37℃稳定14天或冻融稳定50次或配置体系在25℃保留24h后，效果依旧稳定