基于甲基化的MRD检测

MRD阳性患者复发风险显著高于MRD阴性患者，可作为独立的预后因素

通过识别真正需要强化治疗的高危人群，避免低危患者接受不必要的辅助治疗毒性

较影像学提前数月发现分子复发，为早期干预提供窗口期。

DNA甲基化是最具代表性的表观遗传修饰形式，主要发生在CpG二核苷酸位点的胞嘧啶上，生成5-甲基胞嘧啶（5mC）。正常细胞甲基化模式稳定，而肿瘤细胞会出现基因组整体低甲基化、抑癌基因启动子区高甲基化的特征性改变，进而导致抑癌基因沉默、原癌基因异常激活，参与肿瘤发生、进展全过程。该表观特征在肿瘤细胞中稳定性强，是理想的检测靶点。

循环肿瘤 DNA（ctDNA）是肿瘤细胞发生凋亡、坏死后释放至外周血中的游离 DNA 片段，完整保留了肿瘤细胞的基因组与表观修饰信息。基于ctDNA的甲基化MRD检测属于无创液体活检技术，无需依赖手术组织样本，可反复采样，适配术后长期动态监测场景。临床肿瘤DNA甲基化分析常用的血液组分如下：

ctDNA是目前实体瘤MRD检测最常用且信息量最丰富的标志物，可同时提供定量与定性信息，反映肿瘤负荷、克隆演变及治疗响应。相较于突变检测，ctDNA甲基化标志物具有以下技术特征：

抑癌基因启动子区CpG岛在健康人群中几乎完全未甲基化，而肿瘤组织中呈现高甲基化，背景噪音极低

不依赖于患者特异性突变，可设计固定panel实现"肿瘤不知情"（Tumor-agnostic）检测

甲基化模式在肿瘤进化中相对稳定，可覆盖肿瘤异质性

在低肿瘤负荷或低脱落肿瘤（如早期肺癌）中，甲基化检测较突变检测展现出更高的敏感性。

ctDNA是肿瘤细胞通过主动分泌、凋亡或坏死释放入循环系统的DNA片段，长度主要集中在150–200 bp，较非肿瘤来源的cfDNA更短（90–150 bp vs. 250–320 bp），半衰期约1–2小时。ctDNA水平与肿瘤分期、负荷、血管化程度及治疗响应相关，但在MRD场景下其丰度极低（变异等位基因频率VAF可低至0.01%以下），对检测技术的灵敏度提出了极高要求。

采集10–20 mL外周血于含细胞稳定剂的专用采血管中，避免基因组DNA污染；两部离心法分离血浆；采用磁珠法或硅胶膜柱法提取cfDNA，回收片段长度集中在100–300 bp。

DNA甲基化检测的核心步骤是将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而5-甲基胞嘧啶（5-mC）保持不变。经PCR扩增后，U转化为胸腺嘧啶（T），从而在序列层面产生甲基化与未甲基化胞嘧啶的差异。

（传统亚硫酸氢盐处理是甲基化检测的“金标准”，但可能导致DNA降解（片段化）和序列复杂度降低，新兴酶学转化方法（如EM-seq）可更温和地将5-mC转化为胸腺嘧啶，保留DNA完整性，并允许在同一反应中同时检测遗传变异和甲基化标记。）

目前临床主流分为甲基化特异性 PCR（MSP）与靶向高通量测序（NGS）两大技术路线：

①甲基化特异性 PCR（MSP）：针对肿瘤特异性甲基化位点设计特异性引物，对转化后核酸进行扩增与荧光定量。该技术操作简便、检测周期短（24 h 内出具结果）、成本可控，适合临床大规模筛查与常规监测，结直肠癌 Septin9、NDRG4 等位点均广泛采用该方案。

②靶向甲基化 NGS 测序：通过探针杂交富集肿瘤差异甲基化区域，构建测序文库后上机检测。可实现单碱基分辨率甲基化定量，支持多位点联合检测，特异性更强，多用于精准预后分层、疑难样本验证。

使用 Fastp 软件过滤低质量测序读长与 PCR 重复序列，依托专业生物信息学软件计算各位点甲基化比例。实验全程设置阳性对照、阴性对照、内参基因三重质控体系，要求检测变异系数（CV）＜5%，数据标准差（SD）＜0.02，确保结果稳定可靠。

检出肿瘤特异性甲基化信号且数值高于设定阈值，判定为 MRD 阳性，提示体内存在肿瘤残留，复发风险升高；未检出特异性甲基化信号或数值低于阈值，判定为 MRD 阴性，提示肿瘤残留负荷极低，远期复发风险较低。

甲基化 MRD 检测具备无创、抗克隆性造血（CHIP）干扰、无组织依赖等独特优势，目前已在结直肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、肝癌等多种实体瘤中开展临床应用，核心应用场景包括预后风险分层、术后复发监测、辅助治疗决策、药物疗效预测。

基于甲基化的MRD检测代表了实体瘤术后监测的重要技术方向。通过靶向ctDNA甲基化标志物（如SEPT9、BCAT1/IKZF1等），结合亚硫酸氢盐转化与高通量定量PCR或NGS技术，可在无需肿瘤组织对照的情况下实现高灵敏度、高特异性的分子残留病灶监测。现有临床证据表明，甲基化MRD在结直肠癌预后分层、复发预警及辅助治疗决策中具有明确价值，并逐步向肺癌、血液肿瘤等瘤种拓展。随着检测技术的标准化、酶学转化方法的成熟及前瞻性干预试验的推进，甲基化MRD检测有望成为肿瘤精准管理的核心工具，最终实现从”分子复发”到”临床治愈”的全病程监控。

翌圣生物作为NGS领域的核心酶原料供应商，凭借六大核心技术平台（双向分子酶理性设计与定向进化平台、蛋白高密度发酵与超洁净纯化平台、分子诊断试剂关键原料研发平台等）与多年行业积累经验，构建了覆盖核酸提取、文库构建、文库定量等全系列产品矩阵，助力科研人员高效开展cfDNA NGS技术的相关研究。

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