研究背景

RNA的m⁶A 与 m⁶Am 是真核生物中极具代表性的两类表观转录组修饰，开展 m⁶A/m⁶Am 甲基化检测具有极高科研价值。其广泛参与卵母细胞成熟、卵母细胞 - 胚胎转换（OET）、合子基因组激活（ZGA）等早期胚胎发育关键过程，同时调控 RNA 稳定性、翻译效率以及逆转录转座子的表达稳态，是生殖发育、表观遗传、疾病机制等领域的研究热点。

但人源与鼠源卵母细胞、植入前胚胎样本十分珍稀，样本起始量极低。传统 m⁶A 测序技术不仅无法同时区分、同步检测 m⁶A 与 m⁶Am 两种修饰，还存在修饰位点分辨率低、背景干扰高、样本消耗量大等诸多局限，难以满足微量珍稀样本的高精度研究需求。

为突破传统技术瓶颈，《Nucleic Acids Research》重磅研究全新开发MeLACE-seq 技术[1]。该技术核心原理是：利用 m⁶A 特异性抗体结合紫外交联，精准靶向锁定 RNA 上 m⁶A/m⁶Am 修饰位点；再借助核酸酶进行可控 RNA 片段化，结合 cDNA 末端线性扩增策略，完成微量样本高通量建库与测序。可一次性同步解析转录起始位点 m⁶Am 帽端修饰与基因内部 m⁶A 修饰全转录组动态图谱，显著提升修饰位点定位分辨率与检测灵敏度，为珍稀胚胎样本的表观修饰研究提供了全新技术方案。

图1. MeLACE-seq 技术原理[1]

  

技术优势

相较于传统 MeRIP-seq、scm⁶A-seq 等方法，MeLACE-seq 具备显著技术优势：

• 适配微量珍稀样本：极低细胞起始量，完美兼容卵母细胞、各阶段早期胚胎等稀缺科研样本；
• 双修饰同步检测：一次实验可同时识别区分转录起始位点 m⁶Am 与基因内部 m⁶A 两种修饰；
• 修饰定位分辨率高：依托MNase温和可控酶切，修饰位点定位精度远超传统富集测序方法；
• 跨物种通用性：可应用于人、小鼠卵母细胞到胚胎发育模型，适用于 RNA 修饰保守性与物种特异性机制研究。

   

核心原料

MeLACE-seq 之所以能实现高分辨率、低背景、适配微量样本的独特优势，微球菌核酸酶（Micrococcal Nuclease, MNase，Cat#14547ES）是不可或缺的核心关键酶，直接决定 RNA 片段化均一性、修饰片段富集效率以及测序数据质量。MNase是一种来源于金黄色葡萄球菌的核酸内切酶。在pH7-10和Ca2+存在的条件下可降解单链、双链、线状、环状等多种形式的DNA或RNA，并产生3'磷酸末端的单核苷酸和寡核苷酸。

在MeLACE-seq实验中，MNase替代传统机械超声打断方式，实现免疫沉淀后 RNA 的温和可控酶切，尤其适配卵母细胞、早期胚胎等低起始量珍稀样本；此外，其酶切特性可选择性保留带有 m⁶A/m⁶Am 修饰保护的目标片段，降解冗余非特异核酸，有效降低测序背景干扰。因此，MNase是该技术实现 RNA 可控片段化、降低测序背景、保障修饰富集特异性的核心工具酶。

  

MeLACE-seq 技术整体实验流程

步骤 1：样本制备与裂解

收集人类 / 小鼠不同发育阶段卵母细胞、植入前胚胎，去除透明带后，置于冰上裂解缓冲液中充分裂解，加入 RNase inhibitor （Cat#14675ES）与 DNase I (Cat#14549ES)处理，降解基因组 DNA 污染，保留完整总 RNA。

步骤 2：抗体交联与免疫沉淀

加入 m⁶A 特异性抗体，4℃旋转孵育结合 RNA 甲基化修饰位点；通过 254 nm 紫外光两次交联，固定抗体与 m⁶A/m⁶Am 修饰 RNA 复合物；加入蛋白 A/G 磁珠，孵育捕获抗体 - 核酸复合物。

步骤 3：MNase酶切

向磁珠结合复合物体系中加入MNase，37℃精准酶切 3 min；可控降解非修饰游离 RNA 区域，仅保留带有 m⁶A/m⁶Am 修饰的 RNA 片段，实现 RNA 精准片段化，酶切时间与酶活可根据样本量灵活微调。

步骤 4：末端修饰与接头连接

酶切后采用碱性磷酸酶(Cat#14511ES)对 RNA 片段 3' 端去磷酸化，通过 T4 RNA Ligase 2, truncated （Cat#14653ES）完成 3' 接头连接；以生物素修饰引物反转录合成 cDNA，经 RNase H 从磁珠上洗脱 cDNA。

步骤 5：cDNA 捕获与线性扩增

利用链霉亲和素磁珠捕获生物素标记 cDNA，连接 cDNA 3' 接头；通过高保真酶（Cat#10140ES）进行预 PCR 扩增，再经 T7 RNA 聚合酶（Cat#10618ES）体外转录，富集目标核酸片段。

步骤 6：杂质去除与文库构建

采用 crRNA 探针杂交结合 RNase H 处理，特异性消耗核糖体 RNA 片段，降低测序背景；去除 DNA 模板后纯化 RNA，反转录并进行索引 PCR，2% 琼脂糖凝胶筛选 250-500bp 目的片段，完成文库构建上机测序。

步骤 7：生信分析

下机数据经质控、比对、去重后，识别 m⁶A 与 m⁶Am 修饰峰，分析不同发育阶段甲基化动态图谱、基因表达与翻译效率关联、逆转录转座子 RNA 修饰调控等生物学机制。

  

系列产品推荐，适配全场景实验需求

翌圣生物深度对标文献实验体系，针对 m⁶A/m⁶Am 甲基化测序及表观转录组研究场景，匹配全套原料酶，一站式满足实验需求。

  

参考文献

[1] Su R, Du Z, Li S, et al. The dynamic landscape and conserved regulation of the m6Am and m6A methylomes during the human and mouse oocyte-to-embryo transition[J]. Nucleic Acids Research, 2026, 54(4): gkag103.

[2] Hoeijmakers W A M, Bartfai R. Characterization of the nucleosome landscape by micrococcal nuclease-sequencing (MNase-seq)[M]//Chromatin Immunoprecipitation: Methods and Protocols. New York, NY: Springer New York, 2017: 83-101.