动物组织样本全基因组甲基化建库（WGBS）全流程指南

2026-10-19

导读

基因组甲基化测序（Whole Genome Bisulfite Sequencing, WGBS）是表观遗传学研究的核心技术之一，通过亚硫酸氢盐处理将DNA中未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而甲基化的C保持不变，结合高通量测序可实现单碱基分辨率的甲基化图谱绘制。作为检测5-甲基胞嘧啶的“金标准”，WGBS能全面解析基因组范围内甲基化模式的动态变化，为肿瘤发生机制、发育生物学及复杂疾病研究提供关键表观遗传学证据，尤其在肿瘤早筛、细胞重编程等场景中具有不可替代的应用价值。

PART.01

样本处理与基因组DNA提取

核心是获得高纯度、高完整性的基因组DNA，避免RNA污染、蛋白质残留及DNA降解，这是WGBS建库成功的基础。

1、样本预处理

新鲜组织：

取50-100mg组织，用无菌生理盐水冲洗去除血液、脂肪杂质，置于无菌离心管，加液氮快速冷冻，用组织研磨仪破碎至粉末状（避免融化）。

冻存组织：从-80℃取出，无需解冻，直接加液氮研磨破碎，杜绝反复冻融（防止DNA断裂）。

2、提取基因组（常规方法）

1、向组织粉末中加入裂解液与蛋白酶K，涡旋混匀，55℃恒温孵育1-2h，每15-20min涡旋一次，确保充分裂解。

2、加入RNase A，37℃孵育30min去除RNA污染，涡旋混匀后静置5min。

3、按试剂盒说明加入提取液（如酚-氯仿混合液），涡旋混匀，12000rpm、4℃离心10min，小心吸取上层水相（含DNA），避免接触中间蛋白层。

4、向水相中加入无水乙醇，颠倒混匀，-20℃静置30min，12000rpm、4℃离心10min，弃上清得DNA沉淀。

5、用70%乙醇洗涤沉淀2次，每次12000rpm、4℃离心5min，弃上清，室温晾干（避免过度晾干）。

6、加入适量TE缓冲液，55℃孵育10min，涡旋混匀使DNA充分溶解，4℃保存备用。

质控要点：不合格样本需重新提取，具体标准：Qubit检测浓度≥1ng/μL，体积≥20μL，起始量建议3-5μg；Nanodrop检测A260/A280=1.8~2.0、A260/A230≥1.5（低于1.5需磁珠纯化）；Agilent 2100或者琼脂糖凝胶电泳检测主带清晰，无明显降解。异常处理：浓度不足可4℃真空浓缩，降解严重需重新采集样本。

3、WGBS建库核心操作流程

步骤包括：DNA片段化、末端修复与加A尾、甲基化接头连接、重亚硫酸氢盐转化、PCR扩增与纯化，每步需严格控制反应条件，确保重复性。

1、DNA片段化

目的是将基因组DNA打断为合适大小（150-300bp），适配后续测序，目前主流的方法有超声破碎法和酶切法。

翌圣生物Hieff® MethyShear 甲基化片段化酶是一种酶的混合物，专为文库制备上游的样本片段化设计和优化。与传统片段化酶相比，该片段化酶保留了甲基化标记。与传统的超声打断相比，本品对模板损伤小，样本损失率低，摆脱了繁琐的超声步骤，让片段化过程变得更加简单高效。适用5 ng - 250 ng的常规动植物基因组、微生物基因组等样本，同时能兼容FFPE DNA样本。

翌圣生物甲基化片段化酶可覆盖多种片段大小需求

2、末端修复与加A尾

修复片段化DNA的末端缺口与羟基，3’端加A尾，为接头连接做准备，两步合并进行以提高效率。

3、甲基化接头连接

连接甲基化修饰接头（含样本标签，区分不同样本），接头经甲基化修饰，避免自身被重亚硫酸氢盐转化，影响测序结果。

4、重亚硫酸氢盐转化

核心原理：未甲基化胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），甲基化胞嘧啶（5mC）保持不变，是甲基化检测的关键，需严格按试剂盒操作。

未甲基化胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），甲基化胞嘧啶（5mC）保持不变

5、PCR扩增与纯化

扩增连接接头后的DNA片段，获得足量文库，选用高保真尿嘧啶耐受型聚合酶，减少扩增偏差。

文库扩增

4、文库质控

文库质控是确保测序质量的关键，需从浓度、片段大小、纯度三个维度检测，只有质控合格的文库才能进行后续测序，具体标准如下：

浓度质控：Qubit荧光定量仪检测，文库浓度满足上机测序要求。

片段质控：Agilent 2100生物分析仪检测，文库片段大小满足上机测序需求，无明显杂峰，无接头二聚体。

5、上机测序与数据分析

将文库进行上机测序，等测序结果导出后进行数据分析流程，在现阶段的WGBS产品中，普遍采用90Gb的测序数据量，可以实现30X左右的原始测序深度，在分析时经常采用过滤5X以下CpG位点的策略。

转化后cfDNA样本甲基化建库和杂交捕获的下机数据基本指标（翌圣生物单链建库试剂盒（12221ES）

翌圣生物相关产品

类别	具体应用	货号	产品名称	备注
核酸提取	提取	18605ES	MolPure® Magnetic Tissue/Cell Total RNA Kit V2 磁珠法组织/细胞总RNA提取试剂盒V2（瓶装）
核酸提取		18391ES	MolPure® Magnetic Animal Tissue DNA Kit 磁珠法动物组织DNA提取试剂盒（瓶装）
酶切		15064ES	FuniCut® MspI
		15063ES	FuniCut® HpaII
		15078ES	FuniCut® AluI
		15217ES	Nt.BstNBI (10 U/μL)
		15067ES	FuniCut® HaeIII
		15225ES	ApeKI (10 U/μL)
		15049ES	FuniCut® BglII
		15029ES	FuniCut® SphI
		15003ES	FuniCut® BamHI
		15015ES	FuniCut® KpnI
转化	盐转	12225ES	Hieff® Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit	超快速柱法
	盐转	12224ES	Hieff® DNA Methylation Bisulfite Kit	柱法，液态转化剂
	盐转	12222ES	Hieff® DNA Bisulfite Conversion Kit	柱法，固态转化剂
	盐砖	12227ES	Hieff® Mag Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit	超快速磁珠法
	盐转	12223ES	Hieff® Mag DNA Methylation Bisulfite Kit	磁珠法
	酶转	12213ES	Hieff® DNA Enzymatic methyl- Conversion Kit	EM-seq
	酶转	12212ES	Recombinant Ten-Eleven Translocase 2.0(TET2.0, with buffer)	TAPS
建库	单链建库	12221ES	Hieff NGS® Methyl-seq ssDNA library Prep kit for Illumina® V2
建库	双链建库	12214ES	Hieff NGS® dsDNA Methyl Library Prep Kit for Illumina®
扩增引物	index	12414ES-12415ES	Hieff NGS® RNA 384 CDI Primer for Illumina® , Set 1-2
扩增酶		12928ES	Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase mix	耐U高保真DNA聚合酶
配套试剂	定量	12645ES	ssDNA Assay Kit	单链定量
	定量	12642ES	1×dsDNA HSAssay Kit	双链定量
	环化	13340ES	Hieff NGS® Dual Barcode Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI/双端barcode MGI环化试剂	环化试剂
	磁珠	12601ES	Hieff NGS®DNA Selection Beads	纯化磁珠