一文详解单细胞 CpG 岛甲基化测序
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2026-05-22
DNA 甲基化是哺乳动物中最稳定的表观遗传修饰，核心为 CpG 二核苷酸中胞嘧啶的甲基化（5mC）与羟甲基化（5hmC），广泛参与基因表达调控、胚胎发育、细胞分化、基因组稳定性维持及疾病发生（如肿瘤、表观遗传综合征）等关键生物学过程。
传统批量甲基化测序（如 WGBS、RRBS）依赖大量混合细胞 DNA，仅能输出群体平均甲基化信号，无法解析细胞间表观异质性，也难以适配胚胎细胞、循环肿瘤细胞、稀有干细胞等微量/珍贵样本，限制了对细胞分化轨迹、肿瘤亚克隆演化、早期胚胎表观重编程等机制的深入解析。
单细胞甲基化测序技术应运而生，可在单碱基分辨率下解析单个细胞的全基因组甲基化/羟甲基化图谱，精准捕获遗传背景一致细胞间的表观差异，为揭示细胞异质性、定义细胞状态、追踪谱系分化提供核心工具。
2017 年《Nucleic Acids Research》，提出了scCGI seq（单细胞 CpG 岛甲基化测序），一种无需亚硫酸氢盐、基于甲基化敏感内切酶（MRE）+ 多重置换扩增（MDA）的单细胞全基因组 CpG 岛甲基化分析技术。
传统亚硫酸氢盐测序技术（如 WGBS、RRBS）应用于单细胞甲基化分析时，存在明显局限：强化学处理会造成 DNA 严重损伤与丢失，导致单细胞间一致性覆盖度极低，同时整体实验成本高昂、操作流程复杂，难以满足单细胞水平高精度、高稳定性的分析需求。为此，本文开发了一种无需亚硫酸氢盐的单细胞 CpG 岛甲基化测序技术，核心创新在于采用甲基化敏感内切酶（MRE）酶切区分甲基化与非甲基化 CpG 岛，同时巧妙利用多重置换扩增（MDA）长片段优先扩增的特性，使甲基化 CpG 岛保持完整长片段并优先扩增，而非甲基化 CpG 岛被酶切成短片段后几乎不被扩增，最终实现单细胞水平高一致性、高覆盖、低成本的 CpG 岛甲基化分析。
研究结果显示，该技术在单细胞水平平均可检测 21,798 个 CpG 岛，占人类全部 CpG 岛的 76%，16 个单细胞样本共同覆盖 20,864 个 CpG 岛，共同覆盖率达 72.7%；与传统单细胞简化亚硫酸氢盐测序（scRRBS）相比，一致性覆盖度提升约 66 倍，能够准确区分 K562 与 GM12878 两种血细胞系，且单细胞甲基化数据与大量细胞（bulk）测序结果高度相关，相关系数 R≈0.9，同时可有效揭示单细胞间的表观遗传异质性。
图1 CGI-seq 技术原理示意图
细胞类型：K562、GM12878、成纤维细胞、诱导多能干细胞（iPSC）。
分解成单细胞：挑取单个细胞至 PCR 管。
单细胞加入3 μL裂解缓冲液，室温10 min裂解。然后乙醇纯化。
酶组合：SacII + NaeI + EagI + BssHII（文章称 4E）；
酶切特点：只切未甲基化 CpG 岛；甲基化 CpG 岛因 CpG 被甲基化，不被切割、保持长链（>4.4 kb）；
结果：
Me‑CGI（甲基化） → 长片段（≥4.4 kb）
Um‑CGI（非甲基化） → 短片段（≤2.3 kb）
原理：phi29 聚合酶极强的长片段偏好性；
≥4.4 kb 长片段：高效扩增；
≤2.3 kb 短片段：扩增效率下降 > 50 倍，几乎被耗尽；
结果：间接富集甲基化 CpG 岛，非甲基化信号被 “过滤”得到约 3–4 μg DNA，用于建库。
图2 qPCR 结果显示，多重置换扩增（MDA）会消耗 2.3 kb 及更短的片段，但选择性扩增 4.4 kb 及更长的片段。
常用：BstUI 或 AciI+BstUI+Hinp1I（ABH）；
结果：在所有 CpG 岛高频切割，保证甲基化区域均匀碎片化。把 MDA 扩增出来的长片段切成 100–400 bp，适合 NGS 建库。
图3 展示了 22 号染色体上 2 个 CpG 岛（CGI）周围的 RE1 和 RE2（BstUI）酶切位点。RE1 和 RE2 两种酶的识别位点在这两个 CGI 中高度富集，而 RE1 在基因组其他区域的切割频率极低。
▶️ 对 TEST 和 MC 构建 Illumina 文库、上机测序；
▶️ 比对参考基因组（hg19）；
▶️ 统计每个 CpG 岛的 reads 数，结合 MC 阈值，判定甲基化状态；
▶️输出：单细胞全基因组 CpG 岛甲基化图谱。
无亚硫酸氢盐损伤：避免了亚硫酸氢盐处理导致的 DNA 断裂和模板丢失，尤其适合低起始量样本。
高覆盖一致性：16 个单细胞样本中，72.7% 的 CpG 岛可被共同覆盖，高于传统 scRRBS 和 scBS 技术。
低成本高性价比：低测序深度下仍能保持高相关性，大幅降低了单细胞甲基化分析的成本。
可拓展性强：原理可延伸至 5hmC 等表观修饰的检测，适配肿瘤异质性、发育分化等研究场景。
CGI‑seq 的关键步骤在于 MDA 扩增，以及文库构建的稳定性。翌圣生物可提供完整、国产化、高性价比的试剂组合，完美匹配该技术的核心需求。
应用案例
实验以 1~5 个微量细胞为起始样本，采用 MDA 法单细胞全基因组扩增（WGA）获得扩增产物；取 100 ng WGA 产物作为建库起始模板，经 6 轮 PCR 预扩增、25 分钟酶切片段化处理后，构建基因组测序文库，文库主峰片段长度集中在 300 bp；酶切接头连接后采用 0.6× 磁珠比例进行纯化，文库扩增结束后以 0.9× 磁珠二次纯化，最终洗脱体积设定为 42 μL，完成标准化文库制备。
结果显示：1~5个细胞样本，试剂盒扩增产物大小在2-100 kb之间，产量≥ 5 μg；12512的CV值低于竞品C，扩增均一性更好。
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流程 |
竞品C |
12512 |
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扩增体系 |
50 μL |
20 μL |
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程序 |
30℃ 2 h，65℃ 10 min，4℃ hold |
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WGA产量（μg） |
28.1 |
29.9 |
11.84 |
11.48 |
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13570建库 文库产量（μg） |
2.56 |
2.57 |
2.77 |
2.65 |
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Sample |
Raw Bases(G) |
Clean Q30(%) |
Clean GC(%) |
Clean/Raw Reads(%) |
Map Reads(%) |
dup Reads(%) |
CV% |
Depth |
Coverage(%) |
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竞品C |
1.31 |
98.67 |
39.51 |
98.22 |
99.54 |
0.98 |
31.26 |
0.03 |
3.37 |
|
竞品C |
1.45 |
98.65 |
39.60 |
98.18 |
99.56 |
0.88 |
30.40 |
0.03 |
3.37 |
|
12512 |
1.26 |
98.63 |
39.99 |
98.40 |
99.33 |
1.10 |
30.84 |
0.03 |
3.35 |
|
12512 |
0.92 |
98.57 |
39.87 |
98.44 |
99.30 |
1.26 |
30.03 |
0.03 |
3.34 |
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产品类别 |
产品名称 |
产品编号 |
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DOP-PCR |
Hieff NGS® Single Cell/Low Input WGA Kit 单细胞或低投入量全基因组扩增试剂盒 |
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MDA |
Hieff NGS® Single Cell WGA Kit（MDA）单细胞全基因组扩增试剂盒（MDA） |
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酶切法建库 |
Hieff NGS® C169P1 OnePot Pro DNA Library Prep Kit 一步法DNA建库试剂盒 |
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机械法建库 |
Hieff NGS® DNA Library Prep Kit 2.0 机械法DNA建库试剂盒 |
