NGS入门1：从样本到文库，需要经历的步骤

首先从细胞、组织、血液等样本中提取基因组DNA，去除蛋白质、RNA、抑制剂等杂质，确保样本质量；通过Nanodrop检测纯度（A260/A280≈1.8，A260/A230≈2.0）；琼脂糖凝胶电泳检测完整性；使用Qubit荧光计及ds DNA Qubit定量试剂准确定量核酸浓度。

将完整的基因组DNA打断为测序平台兼容的片段（如illumina平台通常为300-600bp），常用两种方式：①物理法：超声波破碎（Covaris）、雾化（Nebulization）；②酶切法：Tn5转座酶、片段化酶（非特异性核酸内切酶混合物），其中酶切法因操作简便和通量高，已成为主流方式。

片段化后的DNA末端存在参差不齐的黏性末端（5’突出或3’突出），需通过末端修复将其转化为平末端，并在5’端磷酸化、3’端添加单个A碱基——该设计可与带有T尾的测序接头互补结合，避免接头自连，是接头连接的关键前提。

将人工合成的测序接头（如illumina测序平台接头引物含P5/P7序列、Index序列和Rd1和Rd2序列，用于测序仪识别和样本区分）连接到修复后的DNA片段两端，形成完整的文库前体，接头连接效率直接影响文库转化率。

通过磁珠纯化去除多余的接头和接头二聚体、去除接头连接试剂中的酶、化学组分等，得到纯净的连接有接头序列的DNA片段，如果经过磁珠分选将得到目标片段大小的文库，进一步缩窄文库片段大小分布的范围。

连接接头后的文库片段量通常较低，需通过PCR扩增富集；扩增后通过磁珠纯化去除多余的引物、PCR试剂中的酶等组分，获得合格的纯净的DNA文库，最终通过浓度检测设备（如Qubit）、片段质检设备（如Agilent 2100）检测文库浓度和片段分布。

从样本中提取总RNA（或特异性富集mRNA），去除基因组DNA、蛋白质及RNase污染，通过Nanodrop检测纯度（A260/A280≈2.0），Agilent 2100检测RNA完整性（RIN值≥7，用于mRNA建库），避免RNA降解影响后续实验。

总RNA中rRNA占比高达80%-90%，若直接建库会导致测序数据冗余，需通过两种方式富集目标RNA：①mRNA富集：利用mRNA 3’端的poly(A)尾，通过Oligo(dT)磁珠捕获；②rRNA去除：通过特异性探针结合rRNA，再用酶消化去除，适用于低质量RNA（如FFPE样本）和原核生物RNA样本。

将富集后的RNA打断为200-500bp的片段（如适配Illumina平台），常用方式为高温（94℃）+二价阳离子（Mg²⁺/Ca²⁺）处理，或通过RNA片段化酶切割，片段化长度直接影响测序数据的覆盖度。

以RNA片段为模板，通过逆转录酶催化，合成与RNA互补的cDNA第一链，同时加入随机引物或Oligo(dT)引物，确保cDNA的全面覆盖。

去除RNA模板后，以cDNA第一链为模板，合成cDNA第二链，形成双链cDNA，完成RNA向DNA的转化，为后续末端修复和接头连接做准备。

将富集后的RNA打断为200-500bp的片段（如适配Illumina平台），常用方式为高温（94℃）+二价阳离子（Mg²⁺/Ca²⁺）处理，或通过RNA片段化酶切割，片段化长度直接影响测序数据的覆盖度。

通过PCR扩增富集文库，磁珠纯化去除杂质，最终检测文库质量，获得合格的RNA文库。