NGS入门4：植物叶片样本的CUT&Tag建库

2026-10-21

PART 01 CUT&Tag技术简介

CUT&Tag技术原理

CUT&Tag技术的核心在于利用特异性抗体识别靶标蛋白（如组蛋白修饰或转录因子）。通过Protein A/G与抗体Fc段的高亲和性，将Tn5转座酶靶向招募至靶蛋白结合的染色质区域。在激活剂存在下，Tn5转座酶不仅切割靶区域的染色质，同时将测序接头插入切割位点。这一过程将染色质片段化和标签化一步完成，最终通过PCR扩增构建出适用于高通量测序的文库。

植物CUT&Tag的研究意义

与传统方法相比，CUT&Tag在植物研究中具有显著优势：

1、低样本量需求：

仅需几百至几万个细胞核，即可完成建库，特别适合珍贵或难以获取的植物样本（如根尖、特定发育阶段的叶片）。

2、高信噪比：

由于反应在细胞核原位进行，非特异性切割极少，背景信号极低。

3、操作快速：

整个文库构建流程仅需约7小时，无需繁琐的超声破碎和末端修复步骤。

PART 02 植物叶片样本的CUT&Tag建库流程

植物样本由于存在细胞壁、叶绿体含量高以及多糖多酚干扰等问题，CUT&Tag建库前的核心在于高质量细胞核的分离。

试剂准备

1、核心试剂盒：

CUT&Tag建库试剂盒（Hieff NGS® In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina® V2，货号12597ES）

植物细胞核分离试剂盒（Plant Nuclei Isolation Kit，货号44014ES）

2、一抗：

ChIP级别或CUT&Tag验证过的抗体（针对目标组蛋白修饰或转录因子）。

3、二抗：

根据一抗种属选择对应的二抗（如兔源一抗需抗兔二抗）。

4、植物样本处理：

液氮、PBS缓冲液、蛋白酶抑制剂、BSA。

5、其他：

无水乙醇、台盼蓝、DAPI染色液。液

仪器设备

1、低温离心机：

用于细胞核分离（需预冷至4℃）。

2、磁力架：

用于磁珠的吸附与洗涤。

3、PCR仪：

带热盖功能，用于文库扩增。

4、涡旋振荡器：

用于磁珠重悬。

5、显微镜：

用于观察细胞核形态及计数。

6、细胞筛：

70μm和40μm细胞筛，用于过滤植物组织碎片。

7、研钵与研杵：

用于液氮研磨植物组织。

实验步骤

1、植物组织细胞核提取（以翌圣Plant Nuclei Isolation Kit，Cat#44014ES为例）

样本处理：取0.1g-0.2g新鲜植物幼嫩叶片，液氮研磨成粉末。
裂解：将粉末转移至预冷的裂解液中，轻轻混匀，冰上孵育3-5 min。
过滤：通过70μm细胞筛去除大碎片。
离心：4℃低速离心（如500 × g）去除上清，保留沉淀。
重悬与分层：向沉淀中逐步加入不同的分离液，使溶液分为三层，通过密度梯度离心，在交界处收集纯净的细胞核层。
洗涤：用洗涤缓冲液洗涤2-3次，最后用重悬液重悬。
质检：显微镜下观察，细胞核应圆润、完整，杂质少；台盼蓝染色检测核完整性（建议>80%）。

2、CUT&Tag建库（以翌圣CUT&Tag试剂盒，Cat#12597ES为例）

试剂配置：根据样本数量，提前配置对应的buffer，稀释抗体。
细胞核收集：2500rpm(600 × g)离心5min弃上清，收集细胞核，使用Wash Buffer清洗并重选细胞核。
磁珠结合：将活化的ConA磁珠与提取好的植物细胞核悬液混合，室温旋转孵育10分钟，使磁珠捕获细胞核。
一抗孵育：用含洋地黄皂苷（Digitonin）的抗体缓冲液重悬磁珠-核复合物，加入稀释好的一抗，室温旋转孵育2小时或4℃孵育过夜。
二抗孵育：洗涤后，加入对应二抗，室温旋转孵育60分钟。
转座酶结合：洗涤后，加入稀释好的pA/G-Tn5转座酶复合物，室温旋转孵育60分钟。
转座酶激活：彻底洗涤去除未结合的转座酶，加入含Mg²⁺的激活缓冲液，37℃孵育1小时。Tn5酶被激活，切割目标DNA并同时连接接头。
终止与DNA回收：加入终止液、Proteinase K和DNA Spike-in Mix（用于数据校正），55℃消化30分钟。使用试剂盒提供的DNA提取磁珠纯化片段化的DNA。

文库扩增：以纯化后的DNA为模板，使用试剂盒提供的高保真扩增混合液和Index引物进行PCR扩增。循环数需根据细胞投入量和靶标丰度优化。
文库纯化：使用DNA分选磁珠对PCR产物进行纯化，去除引物二聚体和大片段，获得最终文库。

3、文库质检

建库完成后，需对文库进行质量控制：

浓度检测：使用Qubit或PicoGreen进行定量。

片段分布检测：使用Agilent 2100 Bioanalyzer或Qsep检测。合格的文库应呈现“波浪形态”特征峰，主峰大小通常在200-500bp之间（包含插入片段和接头）。

4、植物CUT&Tag实验关键注意事项

样本新鲜度：植物材料务必新鲜、幼嫩。液氮速冻后-80℃保存的样本应尽快使用，避免反复冻融导致细胞核破裂。
细胞核质量是生命线：植物细胞富含多糖、多酚和色素，这些物质会严重干扰抗体结合和酶促反应。务必通过密度梯度离心等方法获得纯净、完整、背景干净的细胞核。
抗体选择：必须使用ChIP级别的抗体，并设置阳性对照（如H3K4me3）和阴性对照（无一抗）。二抗需与一抗种属匹配，并确认与Protein A/G的亲和力。
操作轻柔：在处理磁珠-细胞核复合物时，应始终轻柔吹吸或颠倒混匀，避免剧烈震荡或涡旋，以防细胞核破裂。
Digitonin是关键：其作用是温和地透化细胞核膜，让抗体和转座酶进入。但Digitonin易降解，需现用现配，避免反复冻融。

PART 03 翌圣生物产品解决方案

针对植物CUT&Tag研究中的痛点，翌圣生物（Yeasen）提供了一站式的解决方案，覆盖从样本前处理到文库构建的全流程。

产品类别	产品名称	货号	规格
细胞核提取	Plant Nuclei Isolation Kit植物样本细胞核分离试剂盒	44014ES	2T/10T
CUT&Tag建库	Hieff NGS® In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina® V2 CUT&Tag试剂盒（单靶标）	12597ES	4T/12T/48T
	Hieff NGS® Multi-CUT&Tag Library Prep Kit for Illumina®（多靶标CUT&Tag建库试剂盒）	12592ES	4T/12T/48T
	Concanavalin A-Coated Magnetic Beads 伴刀豆球蛋白A磁珠	19810ES	200μL/1mL/5mL/20mL
定量试剂	1× dsDNA HS Assay Kit 即用型dsDNA qubit定量试剂	12642ES	100T/500T
纯化磁珠	Hieff NGS® DNA selection Beads (Superior Ampure XP alternative)DNA纯化分选磁珠	12601ES	1mL/5mL/60mL/450mL