NGS入门15：动物组织样本的lncRNA建库
NGS入门15：动物组织样本的lncRNA建库
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2026-10-13
长链非编码RNA（Long non-coding RNA, lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸、不编码蛋白质的RNA分子。过去，它们曾被认为是基因组转录的“噪音”，但随着研究的深入，科学家们发现lncRNA在细胞中扮演着至关重要的调控角色。
其表达具强组织与细胞特异性，核心功能覆盖转录调控、转录后调控、染色质重塑、信号转导、组织发育等，广泛参与细胞周期、表观遗传修饰及疾病发生发展进程。它们通过多种机制参与基因表达的调控，例如：
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信号分子：作为细胞状态或环境刺激的响应者。
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诱饵分子：结合并隔离特定的蛋白质或miRNA，从而解除其对靶基因的抑制。
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引导分子：将染色质修饰复合物招募到特定基因组位点，影响染色质结构和基因转录。
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支架分子：作为平台，组装多个蛋白质形成复合物，协同发挥作用。
简而言之，lncRNA是基因调控网络中的关键一环，深刻影响着细胞的增殖、分化、凋亡以及个体发育等多种生物学过程。
动物组织是生命活动的基本单元，其功能和状态直接反映了生物体的健康状况、生长发育和生产性能。对动物组织进行lncRNA测序，能够揭示传统蛋白编码基因无法展现的深层调控机制，具有重要的研究意义：
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发育与分化研究：解析胚胎发育、器官形成及组织分化的时空调控机制，挖掘关键调控 lncRNA。
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疾病机制探索：揭示肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病等的发病通路，筛选疾病标志物与治疗靶点。
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生理功能解析：阐明动物代谢、免疫、应激等生理过程的调控网络，完善基因表达调控图谱。
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育种与改良应用：挖掘畜禽经济性状相关 lncRNA，为分子育种提供候选标记。
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基础生物学突破：补充非编码 RNA 调控理论，拓展 RNA 功能研究边界。
高质量的lncRNA测序始于优质的文库。以下是针对动物组织样本的lncRNA建库标准流程。
可选择翌圣生物磁珠法组织总RNA提取试剂盒（Cat#18605ES）
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无水乙醇
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DEPC水
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液氮
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组织研磨仪或匀浆器
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低温高速离心机
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微量分光光度计（如NanoDrop）
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生物分析仪（如Agilent 2100）
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无RNase的离心管和枪头
试剂配置：按照说明书要求向洗涤液内加入无水乙醇，配置裂解液。
样本前处理：
根据样本类型（组织、悬浮细胞、贴壁细胞）进行裂解处理，室温静置 5min 后得到前处理样本。
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样本类型 |
处理方式 |
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组织样本 |
液氮研磨成粉末，称取 10-15mg 加入 450μL 裂解液（已加PT液）中，涡旋混匀。 |
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悬浮细胞 |
低速离心去上清，加入 450μL 裂解液吹打混匀（不超过 500 万细胞）。 |
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贴壁细胞 |
胰酶消化离心去上清，或直接去除培养基，加入 450μL 裂解液吹打混匀。 |
结合：向前处理样本中加入 550 μL 结合液，涡旋混匀；再加入 20 μL 磁珠悬浮液，室温混匀 5min
磁吸弃液：短暂离心后置于磁力架上，待磁珠吸附完全后，小心吸弃上清。
洗涤：加入 700 μL 洗涤液A，混匀 2min →磁吸弃液。
加入 700 μL 洗涤液B（已加乙醇），混匀 2min → 磁吸弃液。
DNase I 消化（去DNA污染）：加入 100 μL 新配制的 DNA酶消化液，室温放置 15min（每隔 5min 颠倒混匀一次）。
二次洗涤： 消化后需再次用 洗涤液B 洗涤两次，以去除残留的酶和缓冲液。
干燥：磁吸弃液后，开盖室温晾干 5min，确保乙醇挥发（注意： 不能过度干燥，否则降低洗脱效率）。
洗脱：加入 50-100 μL 洗脱液，60℃ 恒温震荡 5min（1600 rpm）。磁吸后，将上清（核酸溶液）转移至新的无酶离心管中。
质量检测：使用微量分光光度计检测RNA浓度和纯度（A260/A280应在1.9-2.1之间），并使用生物分析仪检测RNA完整性（RIN值建议≥7.0）。
可选择翌圣生物人/小鼠/大鼠核糖体去除试剂盒（Cat#12257ES）、链特异性RNA建库试剂盒（Cat#12340ES）
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无水乙醇
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无酶水
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RNA纯化磁珠，Cat#12602ES
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DNA纯化磁珠，Cat#12601ES
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PCR Index引物，Cat#12327-12330ES/Cat#13350-13353ES
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Qubit试剂，Cat#12642ES
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PCR仪
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磁力架
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生物分析仪（如Agilent 2100）
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荧光定量仪（用于文库定量）
2.3.1 rRNA去除
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探针杂交：将 RNA 样品与杂交缓冲液及探针混合，在 PCR 仪中经历 95℃ 变性及缓慢降温至 22℃ 的过程，使探针与 rRNA 特异性结合。
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RNase H 消化：向杂交产物中加入 RNase H 缓冲液和酶，在 37℃ 下孵育 30 分钟，特异性降解与探针结合的 rRNA。
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DNase I 消化：加入 DNase I 缓冲液和酶，在 37℃ 下继续孵育 30 分钟，以去除反应体系中残留的 DNA 模板（探针）。
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RNA 纯化与洗脱：使用磁珠（如 Hieff NGS RNA Cleaner）结合纯化 RNA，经乙醇洗涤去除杂质后，用无酶水洗脱获得去除了 rRNA 和 ITS/ETS 的目标 RNA。
2.3.2 RNA建库
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RNA片段化：将去除rRNA后的RNA与片段化缓冲液混合，在特定温度下反应，将RNA随机打断成所需的片段大小。
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第一链cDNA合成：以片段化的RNA为模板，加入随机引物和逆转录酶，合成cDNA第一链。
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第二链cDNA合成/末修加A：在反应体系中加入dUTP，合成cDNA第二链，从而实现链特异性标记。同时将双链cDNA的末端补平，并在3'端添加一个“A”碱基，为接头连接做准备。
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接头连接：连接含有索引序列（Index）的Y形测序接头。
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连接后纯化：化去除体系中的接头残留。
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文库分选：通过分选，可以将文库的插入片段控制在目标范围内，得到片段分布更加集中均一的文库。
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文库扩增：使用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，富集带有接头的DNA片段。
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文库纯化与质检：使用磁珠纯化去除多余的接头引物以及反应体系，并通过生物分析仪和荧光定量仪检测文库的片段分布和最终浓度。
翌圣生物（Yeasen Biotechnology）提供了一系列高质量的产品，覆盖从样本处理到文库构建的全流程。
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产品名称 |
产品编号 |
产品应用 |
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18605ES |
动物组织RNA提取 |
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Hieff NGS® MaxUp Human rRNA Depletion Kit （rRNA & ITS/ETS）人/小鼠/大鼠核糖体去除试剂盒 |
12257ES |
rRNA去除试剂盒 |
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Hieff NGS® EvoMax RNA Library Prep Kit（dUTP） 预混/预装板式RNA建库试剂盒 |
12340ES |
RNA建库试剂盒 |
