NGS入门8：动物组织样本的ATAC建库，需要哪些试剂、仪器以及实验步骤

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2026-10-10

研究背景

ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing）是一种用于全基因组范围内解析染色质可及性的高通量测序技术。该技术通过高活性的Tn5转座酶特异性识别并切割染色质中结构疏松的开放区域，在切割DNA片段的同时直接连接测序接头，经文库扩增后上机测序，从而精确定位基因组中的开放染色质区域（如启动子、增强子等转录调控元件的位置）。ATAC-seq所需细胞量远少于传统的DNase-seq和MNase-seq，且实验流程可在一天内完成。然而，动物组织样本富含纤维基质、脂肪、血液等多种细胞类型，细胞间连接紧密，其建库流程的核心难点在于细胞核的提取与纯化。本文将从技术原理、应用价值、试剂与仪器清单、详细实验步骤及关键质控等方面，系统介绍动物组织样本的ATAC建库全流程。

图1 ATAC原理图（图片来源：网，侵删）

ATAC-seq在动物研究中的应用价值

在器官发育与组织特异性调控研究中，ATAC-seq可用于解析发育过程中染色质可及性的动态变化。研究人员对发育中的牛组织进行ATAC-seq分析，通过整合ATAC-seq和RNA-seq结果，发现了62个在额叶皮层、93个在肝脏和59个在半腱肌中的潜在组织特异性调控基因。在一项针对绵羊24种组织的大规模研究中，研究人员利用ATAC-seq结合ChIP-seq、CAGE-seq等多组学技术，鉴定出274,682个增强子和25,975个启动子，为理解绵羊组织特异性基因调控提供了重要资源。

在疾病机制与衰老研究中，ATAC-seq已成为探索表观遗传变化的核心工具。一项发表在《Science》杂志的重磅研究对32只小鼠、21种器官中的近700万个细胞进行了单细胞ATAC-seq分析，绘制了详尽的衰老细胞图谱，揭示了衰老对各类组织功能的影响。在非人灵长类研究中，研究人员对约160万个细胞进行了snATAC-seq，绘制了猕猴皮层142个脑区中顺式调控元件的单细胞空间图谱，为理解与疾病相关的基因调控网络提供了重要数据。

在肿瘤发生与微环境研究中，ATAC-seq被广泛应用于绘制癌症染色质可及性图谱。研究人员从癌症基因组图谱组织（TCGA）中选取23种癌症类型、410个肿瘤样品进行ATAC-seq分析，绘制了覆盖23种人类癌症类型的796个全基因组染色质可接近性图谱，平均每种癌症类型中鉴定了近十万个染色质可接近性敏感位点，揭示了一系列与染色质可接近性有关的调控相互作用。

动物组织样本的ATAC建库面临两个主要挑战。

其一，细胞间连接紧密，难以获得高纯度的单细胞核悬液。不同组织类型所需的裂解条件和匀浆方式存在差异，需要针对具体组织类型优化实验参数，如匀浆方式、裂解试剂浓度及离心条件等。

其二，细胞碎片和杂质（如肌纤维、胶原纤维、脂肪滴）会干扰转座酶反应，必须通过多次离心和过滤有效去除。对于肝脏等富含糖原和脂质的组织，细胞核提取需要特殊步骤。

实验材料与仪器

1.提核及建库试剂

类别	试剂作用	说明
细胞核提取	动物组织核提取试剂盒	翌圣核提取试剂盒（12516ES）
蛋白酶抑制剂	提核过程保护蛋白受损	翌圣蛋白酶抑制剂（20137ES）
建库试剂	ATAC文库构建试剂盒	以翌圣生物为例，建库试剂盒(12208ES)
转座酶	Tn5转座酶（含接头序列）	核心酶，避免反复冻融
转座酶缓冲液	Transposition Buffer	为Tn5提供最适反应条件
文库扩增	DNA聚合酶	用于扩增转座酶切割后的DNA片段
纯化分选	纯化分选磁珠	用于DNA纯化核片段筛选
定量试剂	文库定量	精确定量文库浓度

2.主要仪器

仪器名称	用途
低温离心机（4℃）	细胞核提取过程中的多次离心分离(80163ES)
低速离心机	DNA纯化、文库分选的瞬时离心(80151ES)
PCR仪	转座酶孵育及文库扩增(80491ES)
金属浴	转座酶孵育（80121ES）
-20℃冰箱	冻存试剂保存
4℃冰箱	磁珠及部分缓冲液保存
Qubit	DNA浓度定量(80571ES)

常见实验步骤

动物组织ATAC-seq的整体流程可归纳为三个核心环节：动物组织细胞核提取与纯化 → 文库构建与纯化 → 文库质控与测序。

配制提核缓冲液（以翌圣生物试剂盒12516ES为例）：

1）取出 4 x NIB、NPB-A、10mM PMSF（自备）、1M DTT（自备）、100x 蛋白酶抑制剂（自备）于冰上放置；

2）1 x NIB : 2.25 mL /样本，750 μL 4 x NIB +6 μL 10 mM PMSF+3 μL 1M DTT+30 μL100x 蛋白酶抑制剂，加入2211μL ddH₂O，混匀（推荐现配现用）。

3）NPB-B : 500 μL /样本，230 μL 1 x NIB + 345 μL NPB-A，混匀（推荐现配现用）。

4）消化液：1mL Hank's 平衡盐溶液（HBSS）+5* μL 胶原酶（100mg/mL）

【注】: 1、以上 buffer 建议现配现用，请根据实际样本数量现配现用，配制的 buffer 冰上放置。 2、PMSF、DTT 浓度如和说明书中的浓度不一致，配制 1xNIB 时保证终浓度一致，更改H₂O 的体积即可。 3、*不同组织用的胶原酶种类和胶原酶浓度会存在差异，可根据实际的组织更换胶原酶种类及使用浓度。

1.动物组织细胞核提取与纯化

A.组织消化 （选做）

实验开始前，请将离心机 4℃预冷，实验全程在冰上操作。

1、将新鲜或者冻存组织放在冰上解冻，用 PBS 清洗干净。

2、将清洗干净的组织在 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中剪碎至 1-2 mm，放置含有 1 mL 消化液的离心管中，37℃孵育10 min。

3、立即将消化后的组织放置干净的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）清洗 1-2 遍，然后进行组织裂解。

【注】：该步骤只针对研磨工具使用匀浆器，并且难磨的组织 (如肌肉）可以使用胶原酶进行消化；其他组织可直接进行步骤组织裂解。

B.组织裂解

【注】：匀浆器或液氮研磨步骤选其一即可。

1）选用匀浆器：在预冷的组织匀浆器中先加入 1.5 mL 1 x NIB，再加入新鲜或冻存动物组织（15 mg 左右）或消化后的组织，冻存组织需冰上解冻 5min；匀浆，Loose 10 次，Tight 10 次。

【注】：不同匀浆器及不同组织匀浆次数会稍有差异，需根据实际的组织及匀浆器确定研磨次数。

2）选用液氮研磨：将新鲜或冻存的组织取绿豆粒大小（40 mg 左右）放入装有液氮的研钵中，进行研磨至粉末状，然后放置装有 1.5 mL 1 x NIB 溶液的管子中，轻柔震荡混匀或上下颠倒混匀。

【注】组织投入量可根据样本类型核经验调整。研磨过程尽量快速，避免液氮完全挥发完导致样本冻融或降解。

3）将上述步骤中的匀浆液通过 70 μm 细胞筛去除碎片，悬液转移至新的 1.5ml 离心管中。

4）2000 g，4℃离心 5 min。

5）小心去除上清，加入 500 μL1 x NIB 进行重悬。

6）取 500 μL NPB-A 至新的 2.0 mL 离心管中，再吸取 500 μL NPB-B 沿着管壁缓慢加入至 NPB-A 的上层，接着再将步骤5 中的 500 μL 悬液沿着管壁缓慢加入 NPB-B 的上层，此时溶液分为三层。

7）500 g，4℃离心 10 min。

8）上层溶液与 NPB-B 之间的白色核带即为细胞核层（如下图2所示），用 200 μL 移液枪取白色核带至新的离心管中，加入 1mL 1 x PBS 溶液，轻轻吹打混匀，该溶液即为细胞核悬液。

【注】:吸取白色核带层，切勿吸取到杂质。

图2 细胞核提取分层示意图

9）取 10 μL 细胞核悬液进行荧光及台盼蓝染色，用于细胞核计数及显微镜观察。

【注】：收集的细胞核在实验前，建议用台盼蓝染色（40207ES或40208ES）进行细胞核完整性鉴定，细胞核完整性不低于 80%，细胞核完整性过低，容易导致背景噪音。

2.文库构建与纯化

文库构建以翌圣生物ATAC建库试剂盒（12208ES）为例，简要介绍建库流程。

转座酶片段化：

提前配制Transposition Mix，冰上预冷。将配制好的Transposition Mix加入到处理后的细胞核中（已根据实验需要进行细胞核计数），使用移液器轻轻吹打 5-8 次混匀。将上述 PCR 管置于 PCR 仪中，设置反应程序（热盖 55℃；37℃ 30min；4℃ hold），进行片段化反应。将反应结束后的 PCR 管瞬离，立即向每个样本中加入 5 μL 的 Terminate Solution，用移液器轻柔吹打20 次混匀，室温静置 5 min。

基因组DNA回收：

将平衡至室温的 DNA Extract Beads 磁珠，涡旋振荡混匀。吸取 130 μL DNA Extract Beads 至 55 μL 终止后的片段化产物中进行基因组DNA纯化，最终入 25 μL ddH₂O洗脱。

文库扩增：

将纯化后的DNA加入PCR反应体系中（含高保真DNA聚合酶和Index引物），按设定程序进行扩增。循环数可参考推荐循环数或通过预实验优化，避免循环过多导致文库复杂度下降。

文库分选：

由于起始细胞量以及不同种类细胞的染色质开放状态差异，文库大小可能存在不同的分布模式。通过磁珠分选，文库中的大片段可以有效去除，使得文库片段分布在 200-700 bp 左右。进行双轮分选的比例推荐0.55×/1.0×，最终21 μL ddH₂O洗脱终文库。

3.文库质控与测序

浓度测定：

使用Qubit dsDNA HS Assay Kit精确定量文库浓度。

片段分布检测：

使用Agilent 2100 Bioanalyzer或等效设备评估文库片段分布。高质量ATAC文库应在约150-600 bp范围内呈现清晰的周期性峰（对应单核小体、二核小体、三核小体等）。若出现严重的引物二聚体峰（<100 bp）或大片段非特异性扩增产物，需重新纯化或重新建库。

测序：

将质检合格的文库混合后上机测序，推荐测序策略为Illumina平台PE150模式。

【翌圣生物·动物组织ATAC建库完整解决方案】

产品类别	产品名称	货号
动物组织提核	Animal Tissue Nuclei Extraction Kit 动物组织提核试剂盒	12516ES
提核相关试剂	PMSF	58076ES
	DTT 二硫苏糖醇	20311ES
	InStab™ Protease Inhibitor Cocktail for bacterial cell extracts,100×Stock Solution 蛋白酶抑制剂Cocktail（用于细菌提取）,100×储液	20137ES
	PBS (1×) 细胞培养级	41403ES
	Hank's 平衡盐溶液（HBSS）含钙、镁离子，不含酚红，1X	60147ES
染色试剂	0.4% Trypan Blue Solution 台盼蓝染色液（0.4%）	40207ES
染色试剂	Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit 台盼蓝染色法细胞活力检测试剂盒	40208ES
ATAC建库试剂盒	Hieff NGS® ATAC-Seq Library Prep Kit for Illumina® ATAC建库试剂盒	12208ES
纯化分选磁珠	Hieff NGS® Smarter DNA Clean beads (50bp以上) /小片段适用的DNA纯化磁珠（ATAC和CUT&Tag适用）	12600ES
纯化分选磁珠	Hieff NGS® DNA selection Beads (Superior Ampure XP alternative)DNA纯化分选磁珠	12601ES
建库接头	Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina®	17265ES
文库定量	1× dsDNA HS Assay Kit 即用型dsDNA qubit定量试剂	12642ES