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Hieff NGS® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit 双模式RNA建库试剂盒(兼容Illumina和MGI)
产品货号:12308ES08
产品规格:8 T
产品价格:¥ 3672.00
类别:RNA-Seq

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  • 产品信息

     

    产品名称

    产品编号

    规格

    价格/元

    促销价/元

    Hieff NGS®   Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit

    兼容Illumina和MGI双平台以及双模式RNA 建库试剂盒

    12308ES08

    8 T

    3672.00

    3305.00

    12308ES24

    24 T

    9272.00

    8345.00

    12308ES96

    96 T

    29772.00

    26795.00

    产品描述

     

    Hieff NGS® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit是兼容Illumina和MGI双平台的total RNA测序文库构建试剂盒,包含RNA片段化试剂,反转录试剂,常规和链特异性ds-cDNA合成试剂,以及文库扩增试剂。可以衔接mRNA纯化试剂盒或rRNA去除试剂盒构建测序文库。二链合成模块配有两种Buffer,客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。其中链特异性二链合成Buffer中将dTTP替换为dUTP,使cDNA第二链中掺入dUTP,而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板,实现链特异性。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证,最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

     

    产品分

     

    组分编号和名称           

    12308ES08

    12308ES24

    12308ES96

    12308-A


    2× Frag/Prime   Buffer

    80 μL

    250 μL

    930 μL


    12308-B


    1st Strand   Enzyme Mix

    16 μL

    48 μL

    192 μL


    12308-C


    Strand Specificity   Reagent

    50 μL

    150 μL

    580 μL


    12308-D


    2nd Strand   Buffer (dNTP)

    240 μL

    720 μL

    2×1440 μL


    12308-E


    2nd Strand   Buffer (dUTP)

    240 μL

    720 μL

    2×1440 μL


    12308-F


    2nd Strand   Enzyme Master Mix

    40 μL

    120 μL

    480 μL


    12308-G

    Ligation Enhancer

    240 μL

    720 μL

    2×1440 μL


    12308-H

    Novel T4 DNA Ligase

    40 μL

    120 μL

    480 μL


    12308-I


    2×Super Canace® II   High-Fidelity Mix

    200 μL

    600 μL

    2×1200 μL


    *

    Primer Mix*

    40 μL

    120 μL

    480 μL


    12308-K

    Nuclease Free H2O

    100 μL

    300 μL

    1000 μL












    注:*标注表示该成分不包含在本试剂盒,需要额外配置,本试剂盒组分兼容Illumina和MGI双平台,但需要额外配置专属于Illumina®或者MGI®的primer mix(Cat# 13334 Primer Mix for MGI®以及Cat# 13335 Primer Mix for Illumina®).


    运输与保存方法

     

    干冰运输。-20℃保存。有效期1年。

     

    注意事项

     

    一、关于操作

    1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

    2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。

    3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

    4. 请使用无RNase污染的耗材,并对实验区域定期进行清理,推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

    5. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;配备文库构建专用移液器等设备;定时对各实验区域进行清洁(推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾),以保证实验环境的洁净度。

    6. 本产品仅作科研用途!

    二、关于接头连接 (Adapter Ligation)

    1. 本公司可提供Illumina®或者MGI®长接头(Barcoded Adapter)试剂盒和短接头试剂盒,客户可根据实验需求进行选择。

    2. 我们建议选用高质量的商业化接头。如客户使用自制接头,请委托具有NGS引物合成经验的公司,并备注需进行严格的防污染控制。此外,进行接头退火操作时,请在超净台完成。每次只操作一种接头,防止交叉污染。

    3. 使用接头时,请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻;在室温操作时,实验室温度最好不要超过25°C,防止接头解链。

    4. 建库过程中,接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中,所加入的接头体积固定为5 μL,请根据初始的RNA投入量,参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TE buffer,稀释过的接头可在4°C保存48小时。

    表1-1 Input Total RNA量与Illumina接头使用浓度推荐表

    Input   Total RNA

    Illumina   Adapter stock concentration

    10 ng

    1 μM

    100 ng

    1.5 μM

    500 ng

    3 μM

    ≥1 μg

    5 μM

     

    表1-2  Input Total RNA量与MGI接头使用浓度推荐表

    Input Total RNA

    MGI Adapter stock concentration

    100–499 ng

    2 μM

    500–4000 ng

    5 μM

    *可根据不同类型total RNA样本及投入量,按需求适当调整Adapter使用量

    三、关于文库扩增 (Library Amplification)

    1. 本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成,在第一代的基础上,大大增强了扩增的均一性,即使是低拷贝的基因,也能进行无偏好性地扩增。

    2. 文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足,将导致文库产量低;循环数过多,又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增,Input Total RNA 量与相应扩增循环数的推荐。

    3. 表2中推荐的循环数可满足绝大多数建库需求,若您的样本质量较差(如降解严重的FFPE样本),可根据实际情况适当增加循环数。mRNA建库时请特别注意,由于不同物种和组织所提取的 Total RNA中,mRNA的含量差异较大,实验中需根据建库起始量、物种类型及样本处理情况适当调整扩增循环数。

    表 2 Input Total RNA 量与扩增循环数推荐表*

    Input   Total RNA

    Number   of cycles

    Non-stranded

    Stranded

    10 ng

    15

    15

    100 ng

    14

    14

    500 ng

    12

    13

    1 μg

    11

    12

    【注】:*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关,样本质量、片段化条件、分选条件等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑,选择最合适的建库条件。

    四、DNA磁珠纯化与分选 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

    1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠,我们推荐使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

    2. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。

    3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

    4. 转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。

    5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。

    6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

    7. DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用0.1×TE Buffer洗脱,产物于4°C可保存2天,-20°C可保存1个月。

    五、关于文库质检 (Library Quality Analysis)

    1. 通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

    2. 文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit®、PicoGreen®等;基于qPCR绝对定量的方法。

    3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测:Qubit®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时,无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物;qPCR绝对定量基于PCR扩增原理,仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

    4. 文库浓度检测不可使用:基于光谱检测的方法,如NanoDrop®等。

    5. 文库长度分布检测,可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

    六、自备材料 (Other Material)

    1. mRNA富集试剂盒:Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit (Yeasen Cat#12603)

    2. rRNA去除试剂盒:Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (Yeasen Cat#12253)或其他rRNA去除试剂盒。

    3. RNA纯化磁珠: Hieff NGS® RNA Cleaner (Yeasen Cat#12602)或其他等效产品。

    4. DNA纯化磁珠:Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP Beads (A63880)或其他等效产品。

    5. RNA质控:Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效产品。

    6.  Adapters:Complete Adapter for Illumina®使用(Cat#13519-13520或其他等效产品)或Complete Adapter for MGI®使用(Cat#13360-13362或其他等效产品)

    7. 文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品;文库定量试剂。

    8. 其他材料:无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

    建库流程图

     

    1656917017(1).png

     图1 RNA建库操作流程