01

无血清培养

细胞体外培养时需要在培养基中加入血清，以维持细胞的生长和存活。而血清，尤其是牛血清，成分复杂、批间差大和存在病原体污染的可能性，不确定的动物源性对细胞培养会带来显著的外源物质污染风险，因此科研人员对无血清培养基的需求日益增加，目前无血清培养基广泛应用于疫苗生产、单抗、活性蛋白等生物制品和细胞治疗等的领域中。无血清培养基中不含血清，为能够实现与含血清培养基相似的维持和促进细胞生长的功能，其中必须添加白蛋白(Albumin)、胰岛素(Insulin) 和转铁蛋白(Transferrin)等营养成分来替代血清。

02

生长因子在无血清培养中的作用

01

促细胞贴壁

许多细胞必须添加促贴壁物质才能贴壁生长，促贴壁物质一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白和胶原蛋白等。

02

增加细胞存活率

无血清培养基中不含有血清成分，细胞在无血清培养基中生长需要的营养成分更为单一，因此细胞的存活率可能会受到影响。添加适当的生长因子可以改善无血清培养基中的营养条件，进而提高细胞的存活率。无血清培养必需补充的细胞生长的营养物质，如胰岛素、转铁蛋白和血清白蛋白等。

03

促进细胞增殖和功能维持

生长因子可以促进细胞增殖，从而提高细胞的生长速度。在无血清培养基中，添加一些能够促进细胞增殖的生长因子，如表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等，能够有效地促进细胞的增殖。

04

促进细胞分化

生长因子可以促进细胞分化，从而促进细胞的功能发挥。在无血清培养基中，添加一些能够促进细胞分化的生长因子，如转化生长因子β（TGF-β）、神经营养因子（NGF）等，能够有效地促进细胞的分化。

05

提高细胞表型的稳定性

无血清培养基中不含有血清成分，对于某些细胞来说，可能会导致细胞的表型不稳定。添加适当的生长因子可以提高细胞表型的稳定性，从而提高细胞的应用效果。

03

无血清培养基中常添加的生长因子

01

碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)

bFGF是一种肝素结合促有丝分裂蛋白，可在无血清或减血清条件下促进多种细胞的增殖。bFGF是干细胞培养中的一种关键生长因子，它不仅是重要的促有丝分裂因子，还是形态发生和分化的诱导因子。在胚胎干细胞培养中，bFGF有助于干细胞在无血清培养基中保持未分化状态。

02

胰岛素（Insulin）

胰岛素可维持无血清细胞培养液中细胞的生长，调节细胞对葡萄糖、氨基酸和脂肪酸的摄取、利用和贮存，同时抑制糖原、蛋白质和脂肪的分解。胰岛素也具有对抗细胞凋亡的作用。胰岛素通常以每升1-10mg的浓度添加到细胞培养基中。

表1. 胰岛素对细胞作用的分类及特点

	代谢作用	促生长作用	代谢和促生长混合作用
具体效应	刺激糖转运和代谢刺激糖原合成刺激脂肪生成抑制脂肪分解刺激离子外流	刺激 DNA 合成刺激细胞生长和分化	刺激氨基酸内流刺激蛋白合成抑制蛋白降解刺激 RNA 合成
效应发生时间	细胞与激素接触后即刻	几小时或几天	介于两者之间
所需胰岛素的作用浓度	低浓度	高浓度	介于两者之间
胰岛素结合的受体	胰岛素受体	IGF 受体（IGFR）	IR 和 IGF-1 均结合
胰岛素与受体的亲和力	高亲和力	低亲和力	高亲和力和低亲和力均有
生物效应强弱	强	弱	强弱均有

03

胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)

在无血清培养基的配制中，常用IGF-I 来替代胰岛素，IGF-I 在很低的浓度即可实现促细胞生长作用，而胰岛素需要远远高于生理浓度。IGF-1通过与IGF-1受体结合，促进蛋白质合成代谢，影响糖原代谢、DNA合成和葡萄糖摄取，具有抗凋亡作用。在无血清培养基中，IGF-1有助于细胞维持较高的活率和持续增殖的能力。

04

长效IGF-I（LR3 IGF-I）

Long R3 IGF-I (LR3 IGF-I) 也可称为长效IGF-I，与胰岛素相比，LR3 IGF-I添加到无血清培养基中后不容易被降解，作用更持久，因此也叫长效IGF-1。

LR3 IGF-I 是以IGF-I 为基础改造而来。改造后，LR3 IGF-I 仍具有高亲合力结合IGF-IR 的能力，因此保持着与IGF-I 相似的促细胞增殖活性。同时，改造后，LR3 IGF-I与IGF 结合蛋白( IGFBPs)的亲合力明显下降。所有哺乳动物细胞均会分泌IGFBPs，而IGFBP可结合并抑制IGF-I 的活性，而改造后的LR3 IGF-I 与IGFBPs 的亲合力比其原型分子IGF-I 下降1000 多倍，因此其活性可极大程度地避免被IGFBPs 所抑制，从而使LR3 IGF-I 的活性较IGF-I 大为提高。

LR3 IGF-1相比胰岛素，促细胞增殖能力更强，培养的细胞密度更高，细胞活力更好，且LR3 IGF-1比胰岛素在培养液中半衰期更长，生物活性更长效。

表2. 人 LR3 IGF-1、IGF-1和胰岛素的区别

参数	Insulin	IGF-1	LR3 IGF-1
中文名	胰岛素	胰岛素样生长因子-1	长型胰岛素样生长因子-1
蛋白来源	重组表达	重组表达	重组表达
分子结构	异源二聚体	单体	单体
分子量	5.8 kDa(51个氨基酸）	7.6 kDa(70个氨基酸）	9.1 kDa(83个氨基酸）
受体	胰岛素受体（IR）	IGF-1受体（IGF-IR）	IGF-1受体（IGF-IR）
与IGF-1受体结合的亲和力生物学效应	低亲和力促进细胞生长	高亲和力促进细胞生长	高亲和力促进细胞生长
与胰岛素受体结合的亲和力生物学效应	高亲和力调节细胞代谢	低亲和力调节细胞代谢	低亲和力调节细胞代谢
与IGF结合蛋白（IGFBP）的结合	不结合	高亲和力	低亲和力
在细胞培养过程中的稳定性	比较不稳定	稳定	很稳定
无血清培养基中的添加剂量是否高于生理浓度	1-10mg/L 远高于（约100倍）	10-100μg/L 不高于	10-100μg/L 不高于

05

表皮生长因子 (EGF)

一种重要的促有丝分裂生长因子，通过与细胞表面受体结合，促进培养细胞的长期增殖。在无血清细胞或减血清条件下培养基中，诱导多种细胞的分化。

06

肝细胞生长因子 (HGF)

HGF是成熟实质肝细胞的一种强效、间质衍生的有丝分裂原，广泛组织和细胞类型的生长因子。HGF通过MET的跨膜酪氨酸激酶受体发出信号。HGF的活性包括诱导细胞增殖、运动、形态发生、抑制细胞生长和增强神经元存活。HGF是肝脏再生过程中至关重要的有丝分裂原。HGF能够刺激原代无血清培养的肝细胞DNA的合成，对多种组织器官的生长发育具有重要的生理调节功能。

07

转铁蛋白 (Transferrin)

无血清培养基为达到与含血清培养基相同或相似的细胞培养性能，其中也必须添加转铁蛋白，以实现对细胞铁离子平衡的调节，以及对细胞生长和增殖的维持。

分类：转铁蛋白以三种形态存在：脱铁（Apo）（不结合铁离子）、饱和铁(Holo）（结合两分子铁离子）和部分饱和。

如何选择：无血清培养基中多数都添加Holo-transferrin，因为Holo-transferrin 除发挥转铁作用外，自身即可作为细胞的铁源，无需在培养基中另加外源性铁。但在某些本身含铁量高的培养基(如DMEM/F12)中，则可使用Apo-transferrin 这种不含铁的转铁蛋白。

使用浓度：细胞种类不同，对转铁蛋白的需求量也不同，下表仅供参考。具体的浓度还是要根据细胞的种类、状态和想要实现的功能来通过实验确定。

表3.转铁蛋白在无血清培养基中的使用浓度

细胞类型	原代细胞	CHO(中国仓鼠卵巢细胞）	杂交瘤和Vero细胞
转铁蛋白工作浓度	5-100mg/L	10-50mg/mL	5-20mg/mL

转铁蛋白在无血清培养基中的作用：

避免细胞外环境中自由基的产生，防止细胞受到伤害

转铁蛋白可以与铁离子高亲合力结合，当被添加入无血清培养基后，在细胞外的培养环境中基本不会存在游离的铁离子，也就不会发生自由基反应，故可避免自由基对细胞的损伤。

维持细胞的生长和增殖

细胞内有很多重要的蛋白，如血红素、核糖核苷酸还原酶、DNA解旋酶、DNA聚合酶、DNA引物酶等，需要结合铁离子后才能发挥其活性，这些蛋白基本上都与DNA 的复制、修复以及DNA 的稳定性有关，也就是说它们影响着细胞的生长和增殖。转铁蛋白通过与其在细胞表面的受体结合，将铁离子转运并释放到细胞内后，这些铁离子会与需铁蛋白结合，然后发挥后者维持细胞生长和增殖的功能。如果无血清培养基中不含转铁蛋白，细胞内的需铁蛋白将无法获得铁离子，会失去活性，导致细胞生长停滞或死亡。

维持细胞内的铁平衡

在细胞培养中，并不是铁越多越好，而应当是在适当的时间获得适量的铁。如果细胞内的铁过多，也跟细胞外环境一样，铁会诱导产生破坏力极强的羟基自由基。而如果细胞内铁过少，则不足以维持细胞的生长和增殖。转铁蛋白调节细胞内的铁平衡，与细胞表面的转铁蛋白受体有关。细胞表面转铁蛋白受体的数目不是固定不变的，而是随着细胞对铁的需求程度而上调或下调，因而可自主影响细胞对铁的摄取量一般而言，静止未活化的细胞表面转铁蛋白受体相对较少，而活化增殖的细胞表面转铁蛋白受体数目显著增加。此外，在细胞培养中，转铁蛋白受体数目与培养环境中铁的含量也密切相关。培养环境中的含铁介质比较多，则细胞表面转铁蛋白受体的数目会减少，从而避免细胞摄入过量的铁。

08

白蛋白（HSA）

白蛋白是许多无血清细胞培养的重要组成部分，例如杂交瘤或中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的系统。白蛋白具有多种生理功能，包括：金属离子结合剂、自由基清除剂、渗透压和pH值的调节剂、生长因子的运载体、表面活性剂以及营养剂等。

09

纤维连接蛋白（fibronectin，FN）

纤维连接蛋白添加到培养基中，替换或降低血清使用量，促进细胞贴壁、迁移、移动生长、维持细胞状态。具体作用如下：

纤维连接蛋白可以与细胞表面整合素等受体结合,促进细胞与培养皿的粘附,这是细胞成功培养的前提。特别是一些黏附力较弱的细胞,添加纤维连接蛋白可以显著提高其培养成功率。

纤维连接蛋白除了增强细胞附着外,还可以通过与细胞表面受体的相互作用,激活下游信号转导通路,促进细胞周期进程,实现细胞的增殖。

维持细胞形态。纤维连接蛋白与细胞结合后,可以影响细胞骨架的排列和细胞形态的维持。此作用对于某些依赖于reshape的细胞功能和分化很重要。

促进细胞迁移。纤维连接蛋白在体内发挥着引导细胞迁移的作用。在体外培养中可以形成化学梯度以诱导细胞的定向迁移,这对研究细胞转移机制很重要。

诱导细胞分化。不同浓度和构象的纤维连接蛋白，可以与不同类型的细胞相互作用，展示不同的生物学效应，诱导细胞向特定的方向分化。这在定向诱导多潜能细胞分化中很重要。

04

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Human LR3 IGF-1 Protein	92210ES	5μg/100μg
Human EGF Protein	92708ES	100μg/500μg
Human HGF Protein	92055ES	10μg/50μg
Human Holo-Transferrin Protein 重组人转铁蛋白（饱和铁）	92288ES	100 mg/500 mg
Human Holo-Transferrin Protein 重组人转铁蛋白（脱铁）	92289ES	100 mg/500 mg
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