涨知识|qPCR专场八：细节-认真的态度和科学的精神
RNA的完整性可通过Agilent 2100生物分析仪进行分析，其在分析RNA完整性之后能够给出准确的数值（RIN值，全称 RNA Intesity Number），该值在8-10之间表示RNA质量非常好，小于7时表示RNA完整度较差。
实验仪器的准备
内参基因的准备
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GAPDH不适合选作内参的情况
GAPDH基因是糖酵解中的关键基因，在代谢过程中的表达很容易受到多种因素的影响。如在细胞的增殖过程中，细胞需要的能量ATP增多，糖酵解代谢加大，GAPDH基因的表达水平很有可能被上调。有报道称，该基因可作为肿瘤发生的标志物，在肿瘤组织与正常细胞及癌旁正常组织比较时，GAPDH表达并不一致。故在比较肿瘤组织与正常组织或细胞的某种基因或蛋白的表达时，GAPDH作为内参应慎重。
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β-actin不适合选作内参的情况
对于actin蛋白由几种异构体组成，actin大致可以分为6种，不同actin之间具有较大的序列相似性(>90%)。在肌肉组织中β-actin分布很少，心肌中主要是alpha-cardiac muscle actin蛋白。故并不是所有的组织都适合选β-actin作为内参。例如当细胞向恶性转化时，β-actin mRNA的表达水平增加；而假基因的存在也可干扰β-actin的检测，此时并不适合选择β-actin作为内参。
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18S rRNA不适合选作内参的情况
rRNA的转录易受到各种生物因素和药物的影响。在有丝分裂期间，28S、18S rRNA明显减少或停止表达。此外存在很大争议的是rRNA不包括poly(A)尾，在以oligo(dT)为引物的cDNA合成中不能被逆转录，建议在反转录的过程中除用oligo(dT)引物外，还要用18S作为反向引物，反转录后的cDNA最好用RNA酶处理一下，再高温灭活。
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通过查询研究相同或类似对象的文献，获取相关的内参信息并测试； -
查询实时定量PCR内参基因知识库—ICG(https://ngdc.cncb.ac.cn/icg/),获取相关的内参信息并测试； -
选择实验室已经常用的内参，进行预实验测试。
加样环境需保证
试剂准备需注意
加样过程需谨慎
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加样顺序尽量选用先加大体积，后加小体积的方式；先加NTC，后加模板。加样顺序的把控可尽可能减少操作误差和污染风险。 -
枪头勤更换，以减少交叉污染的风险。在重复组和样品类型之间需在每次吸取后更换枪头。在加样过程中，不要让枪头穿过其他孔或不同的样品/检测类型。 -
灵活使用移液枪，尽可能提升孔间重复和加样精准。针对10 μL及以下的小体积液体吸取，采用二档吸取(按到底)，一档排出(不按到底)。当孔中有液体时，小体积液体加样，需选用低吸附枪头伸入至液面以下进行排出，减少液体残留在枪头内的现象。
密封、混合需全面
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加样至96孔板前后，切勿使用记号笔等在板的表面或者板底部写字，这会干扰荧光激发和信号检测。另外类似墨水等物质可能会在qPCR仪器中从板上转移至仪器模块上，这类有色或荧光物质污染模块后会对当前乃至后续的荧光定量PCR数据产生不利影响。用封板膜封板后，需检查板的顶部以及验证是否与板良好接触，尤其是边缘部分。 -
在正式上机前需对反应组分充分离心混合，若混合不均匀，精准度和效率可能会受到影响。另外需检查孔中是否存在气泡或黏附在孔壁上，若存在，需轻轻敲击管子底部后短暂离心，从而消除溶液中的气泡。
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反应体积是否填写正确---需按照实际反应体积来进行填写； -
延伸环节荧光采集开关是否打开---若荧光采集开关未打开，则会发生无扩增曲线的现象； -
熔解曲线程序不同仪器各不相同，上图中仅以Abi Q5为例，通常选用仪器默认的信号采集程序即可。
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方法 |
分类 |
产品名称 |
货号 |
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RNA提取 |
同Trizol提取 |
TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent |
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动物组织/细胞总RNA提取，避开有毒试剂，最快15 min完成 |
MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit细胞/组织总RNA提取试剂盒 |
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简单植物总RNA提取，避开有毒试剂，最快40min完成 |
MolPure® Plant RNA Kit 植物RNA提取试剂盒 |
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多糖多酚植物总RNA提取，最快30min完成 |
MolPure® Plant Plus RNA Kit 多糖多酚植物RNA提取试剂盒 |
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细胞总RNA提取，避开有毒试剂，最快8 min完成 |
MolPure® Cell RNA Kit 培养细胞RNA提取试剂盒 |
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qPCR染料法 |
高灵敏通用型定量预混液(染料法) |
Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Master Mix |
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超高性价比定量预混液 (染料法)，已发文章累计IF达到5000+ |
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) |
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Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) |
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Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) |
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高灵敏型qPCR预混液（染料法） |
Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) |
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Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) |
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Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) |
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miRNA加A法高特异性定量预混液(染料法) |
Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（加A法） |
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miRNA茎环法高特异性定量预混液(染料法) |
Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（茎环法） |
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高灵敏一步法反转定量试剂盒(染料法) |
Hifair® III One Step RT-qPCR SYBR Green Kit |
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细胞直扩RT-qPCR，1.5 h从细胞到基因表达分析(染料法) |
Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit |
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反转录试剂 |
5 min快速反转，最长可满足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游应用PCR/qPCR)-示踪版New |
Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit |
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5 min快速反转，最长可满足14 kb cDNA合成，含gDNA去除(下游应用PCR/qPCR)-常规版New |
Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit（No Dye） |
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15 min一步完成gDNA去除与反转录(下游应用qPCR) |
Hifair® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR |
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高质量第一链cDNA合成预混液，含gDNA去除(下游应用qPCR) |
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) |
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最长可满足19.8 kb cDNA合成试剂盒，含gDNA去除(下游应用PCR/qPCR) |
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus) |
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常规30 min反转预混液,含gDNA去除（下游应用qPCR） |
Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) |
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miRNA反转录试剂盒（加A法） |
Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit （加A法） |
