RPA+CRISPR一管双检，翌圣原料解决方案

现性传播感染防控存在双重负担，“一次采样、同步检测人类免疫缺陷病毒（HIV，RNA病毒）和梅毒（TP，DNA细菌）” 已成为现实刚需。

ACS Sensors 新近报道了一种HIV和TP一体化检测方案，将逆转录、RPA、IVT 以及 Cas12a/Cas13a 双 CRISPR 酶检测整合于单管，37℃等温反应，搭配按压式血浆分离芯片与手机判读，可在 30 分钟内完成从全血到检测结果的全过程。

图1：双靶点检测全流程示意图

这套体系的难点，不在 “怎么设计 CRISPR RNA（crRNA）”，而是怎么让多酶在同一管、同一温度下互不打架。

一锅法的精髓

不是把试剂混在一起，而是让两条通路各走各的

01

该体系核心是在单管内同步完成多重酶促反应，难点在于区分 HIV（RNA 靶标）与梅毒螺旋体（DNA 靶标）信号；方案不依靠荧光编码或空间分隔，而是利用 Cas12a 识别 DNA、切割 ssDNA 探针，Cas13a 识别 RNA、切割 ssRNA 探针的底物特异性实现信号正交：

HIV 的 RNA 经逆转录、RPA 扩增后由 Cas12a 触发 FAM 绿光信号；

梅毒靶标经 RPA 引入 T7 启动子、IVT 生成 RNA 后由 Cas13a 触发 ROX 红光信号；

两条通路共管 37℃等温反应。配套按压芯片省去核酸提取，依靠血浆分离膜去除血液抑制物，滤液直接复溶冻干试剂。

图2：双“通道”检测原理简图

把反应拆开

每一支酶要交的“作业”都不一样

02

把反应按顺序拆开，会发现每支酶面对的约束并不一样。

2.1逆转录酶：把 RNA 靶标翻译成 DNA 语言

HIV 通路第一步的逆转录酶（reverse transcriptase，RT），需要在 37℃、组分复杂的一锅体系中工作，区别于常规 RT-qPCR；它要求逆转录效率高、RNase H 活性可控，且低甘油适配冻干。一锅法对逆转录酶更看重稳定性，需要适当提高酶量，保证启动快，同时避免提前消耗模板。

图3：逆转录酶作用原理图

2.2RPA 的核心蛋白，加上几个容易被忽略的配角

RPA 依靠重组酶在常温下解链扩增：UvsX、UvsY、gp32 和 Bsu 聚合酶四酶配比是扩增关键；UvsX 消耗 ATP，需要肌酸激酶 - 磷酸肌酸 ATP 再生系统持续供能，荧光探针体系还可搭配 Exo III，Tris、钾盐、PEG、DTT、镁离子等缓冲组分同样影响反应启动。另外商品化酶常含高甘油，不利于冻干，一锅冻干体系优先选用无甘油或低甘油酶。

图3：RPA工作原理图

2.3T7 RNA 聚合酶：给第二条通道“造”一个 RNA 靶标

梅毒靶标为 DNA，但 Cas13a 仅识别 RNA，在 RPA 引物上引入 T7 启动子，以 RPA 扩增产物为模板，由 T7 RNA 聚合酶原位转录生成 RNA 供 Cas13a 检测。

这要求 T7 聚合酶在 37℃、多酶共存体系中稳定活性：转录太强会竞争核糖核苷三磷酸（rNTP） 升高背景，转录不足则靶标不够；优先选择低双链 RN(dsRNA)、批间稳定的 T7，相比单纯追求高酶活更合适。

2.4Cas12a：识别只是第一步，反式切割才是信号放大器

Cas12a 具备信号放大效应：crRNA 引导其结合 DNA 靶标激活后，可非特异性切割周围 ssDNA 报告探针，实现一靶多信号。

一锅法存在一个难点：Cas 蛋白会顺式切割原始靶标，在扩增产物足量前提前消耗模板；可通过 crRNA 识别位点设计与组合筛选规避该问题，同时 Cas 的比活性、切割偏好及批间稳定性，直接决定体系可重复性。

图4：Ca12a作用原理图

2.5RNA 酶抑制剂：最不起眼，也最不能省的一支

体系里同时有 RNA 靶标、逆转录产物和 T7 转录出的 RNA，一点核糖核酸酶（RNase）污染就可能让 RNA 通道失效。常见做法是加RNA 酶抑制剂（RNase Inhibitor），冻干体系里优先选无甘油版本。这类“辅助酶”用量不大，但往往是批间差异和现场失败率的来源。

从论文到产品

冻干配方和批量供应，才是真门槛

03

该体系尚在实验室阶段，产品化方案清晰：冻干单管试剂、按压芯片配合手机判读，难点在于冻干和复溶稳定性。

冻干优化涉及缓冲体系、酶量、甘油残留、保护剂配比、冻干曲线、残水及复溶性能等多项参数；RPA 体系高蛋白、高 PEG 特性极易造成冻干塌陷、喷瓶或活性损失，推向产品还需验证批间一致性、运输稳定性、加速老化并完成注册。

此外规模化供应也是难点：研发阶段可优选酶原料，产业化则要求酶原料 CV 可控、产能成本稳定、持续供货，且多种酶活性需要匹配，更换供应商常需重新优化配方，这也是很多团队选择酶原料与冻干工艺放在同一个上游开发的原因。

应用前景

从性病双检，到一张“症候群面板”

04

优先落地场景包括生殖健康门诊、婚孕前检查、术前、献血筛查、基层及口岸公卫，这类场景要求快速出结果、设备轻便。

依托底物正交 Cas 体系开发呼吸道、发热、消化道等症候群面板；技术逻辑还可迁移至非洲猪瘟等动检、农残、食安与生物安全现场检测，适配等温冻干特性，这也需要原料与试剂端协同优化，支撑产品化。

翌圣能提供的原料

从单酶到冻干成品

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产品类型	产品名称	货号
RPA预混液	DNA Rapid Isothermal Amplification Kit（Fluorescent）	16702ES/16904ES
	RNA Rapid Isothermal Amplification Kit（Fluorescent）	16708ES/16905ES
	DNA Rapid Isothermal Amplification Kit（Chromatographi）	16725ES/16906ES
	RNA Rapid Isothermal Amplification Kit（Chromatographi）	16726ES/16907ES
	DNA Rapid Isothermal Amplification Kit (Basic)	16727ES/16908ES
	RNA Rapid Isothermal Amplification Kit (Basic)	16728ES/16909ES
RPA单酶	T4 UvsX Recombinase T4 UvsX重组酶 (2 μg/μL)	11079ES
	T4 UvsY protein T4 UvsY蛋白 (2 μg/μL)	11080ES
	T4 Gene 32 Protein（gp32，10 μg/μL）	14414ES
	T4 Gene 32 Protein, gp 32 (5 μg/μL)	11081ES
	Bsu DNA Polymerase（Large fragment，50 U/μL）	14415ES
	Bsu DNA Polymerase（Large fragment，5 U/μL）	11078ES
	Creatine Kinase（2 μg/μL）	14502ES
	Exonuclease III 核酸外切酶III (100 U/μL)	14525ES
	2× RPA Amplification Buffer 通用型RPA Buffer	16928ES
逆转录酶	Hifair UCF. ME® Advanced Reverse Transcriptase, Glycerol-free(200 U/μL)	14617ES
	Hifair® V Reverse Transcriptase (600 U/μL, Glycerol-free)	11301ES
T7 RNA聚合酶	T7 RNA Polymerase（250 U/μL）	10626ES
	T7 RNA Polymerase GMP-grade（50 U/μL）	10624ES
	T7 RNA Polymerase GMP-grade（250 U/μL）	10625ES
	Hieff® T7 RNA Polymerase GMP-grade (low dsRNA, 250 U/μL)	10629ES
	T7 High Yield RNA Synthesis Kit（low dsRNA）	10633ES
Cas蛋白	ArCas12a Nuclease（10 μM）	14702ES
	AapCas12b Nuclease（10 μM）	14808ES
RNA酶抑制剂	Murine RNase Inhibitor（200 U/μL，Glycerol-free）	10703ES

注：部分产品未上官网，可正常供货，详询当地业务员。

*资料来源：ACS Sensors（2026）Integrated Single-Step Duplex CRISPR-Based System for Point-of-Care Detection of Human Immunodeficiency Virus and Treponema pallidum Directly from Whole Blood；