CRISPR-Screen 全流程解析与翌圣原料解决方案
CRISPR-Screen 全流程解析与翌圣原料解决方案
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2026-10-20
CRISPR-Screen，也就是 CRISPR 功能基因组学筛选，如今已成为药物靶点发现、合成致死研究、耐药机制解析的标配工具。但很多刚接触这个技术的同学都会有一堆疑问：一个完整的 CRISPR-Screen 到底在做什么？整个实验要走多少步？周期有多长？
▍一句话概括：CRISPR-Screen 就是把成千上万条 sgRNA"打包"成一个病毒/质粒文库，低 MOI 感染细胞，让每个细胞只敲除（或激活/抑制）一个基因，然后在筛选压力下看哪些 sgRNA 富集了、哪些缺失了，反推这个基因的功能。
1. 给每个基因配一把"钥匙"：针对成百上千个候选基因，分别设计若干条 sgRNA，让它们能特异性识别并切割（或调控）对应基因。
2. 把钥匙装进文库：通过 oligo 合成 + 克隆，把所有这些 sgRNA 整合进同一套病毒或质粒载体，形成"文库"。
3. 让细胞"随机中招"：低 MOI（感染复数）感染细胞群体，使每个细胞平均只拿到一条 sgRNA，从而只丢失/调控一个基因。
4. 用压力"筛选"：对细胞施加药物、营养缺陷、特定环境等筛选压力，能活下来或长得好的细胞，其 sgRNA 对应的基因往往就是"关键基因"。
5. 测序"读牌"：从高通量测序数据中定量每条 sgRNA 的丰度变化，通过 MAGeCK 等工具把 sgRNA 水平信号汇总到基因水平，筛选出显著富集或缺失的基因，再做 GO/KEGG 通路富集，最终回答 "哪些基因在筛选条件下影响细胞存活"—— 比如药物筛选中找到耐药靶点或合成致死搭档，增殖筛选中找到必需基因或抑癌基因。
常见的筛选类型包括：
- CRISPR KO（基因敲除）：用 Cas9 直接切断 DNA 双链，造成 indel 失活。
- CRISPRi（基因表达抑制）：用 dCas9-KRAB，只结合不切割，抑制转录。
- CRISPRa（基因激活）：用 dCas9-VPR，结合后激活转录。
- 双 sgRNA 组合筛选（Dual-sgRNA）：同时引入两条 gRNA，研究基因之间的互作或合成致死关系。
文库规模从几千条（靶向特定通路）到十几万条（全基因组）不等，一次完整筛选周期大约 6–10 周。由于 CRISPR 编辑不依赖特定物种，结合转基因动物模型与病毒靶向递送，还能在体内实现组织特异性的筛选。
| 环节 | 时间 | 核心动作 |
| 1. 基因组合与 sgRNA 设计 | 1–2 周 | 确定靶基因集合、设计每条基因的 5–10 条 sgRNA |
| 2. Oligo pool 合成与 QC | 1–2 周 | 芯片合成 oligo pool，NGS 验证准确性 |
| 3. sgRNA库构建 | 3–4 天 | oligo→载体无缝克隆→电转→质粒大提→NGS 验证覆盖度 |
| 4. 病毒包装 | ~2 周 | 293T 三质粒转染→收毒→滴度测定 |
| 5. 细胞/组织库构建 | 3–5 周 | 低 MOI 感染→药筛→T0/Tend 采样（覆盖度 200×） |
| 6. gDNA 提取与测序文库构建 | 3–5 天 | 提取基因组 DNA→PCR1 富集 sgRNA 区→PCR2 加接头/index |
| 7. 测序与生信分析 | 依测序平台 | 扩增子测序→MAGeCK RRA→GI score 命中基因 |
图1 CRISPR-Screen 全流程（Tang et al., 2022, Cell Press）
接下来，针对操作流程展开逐项详解。
1. 基因组合与 sgRNA 设计与序列鉴定
全基因组文库由于基因数量过多，往往很难获得理想的筛选信噪比。实践中更推荐的做法是：根据自身研究方向定制或选用针对性的 sgRNA 亚文库，基因数量选择在 500–2000 之间，每条基因设计 5–10 条 sgRNA，这样既能覆盖关键通路，又能把筛选深度做够。
如果已有现货文库（如 RBP / 泛素化 / 转录因子 / 膜蛋白 / 表观遗传等方向），直接选用性价比最高；若想更贴合自己的课题，更理想的方案是：结合自身转录组或临床样本数据，制定个性化基因清单，再构建到最契合的载体上。
2. Oligo pool 合成与 QC
sgRNA oligo pool 通过芯片合成仪合成，是极微量的单链 DNA。oligo 池的质量直接决定下游文库的质量——因此合成之后，通常会用 NGS 对其做 QC 验证，确保每条 oligo 的实际序列与预期一致、无系统性的合成偏倚。这一步是后续文库能否"保真"的前提。
3. sgRNA 库构建
sgRNA 文库构建的核心，是把化学合成的 oligo pool 插入慢病毒（或质粒）载体。传统酶切-连接效率低、背景高，现在主流做法都是无缝克隆（如 Gibson 组装），能把多条片段一次性高效拼接。
- 双 sgRNA 文库的特殊要求：需要先插入第一个 gRNA、再插入第二个，属于两次顺序组装，对克隆效率要求更高。
- 稳定扩增的关键：慢病毒质粒在大肠杆菌里容易发生重组，因此文库扩增通常选用重组缺陷型菌株，并且 30°C 培养比 37°C 更稳定，能显著降低质粒重排风险。
- 覆盖度要求：一般要求重组克隆子数量 ≥ 文库 oligo 条数的 200×。例如 5000 条 oligo 的文库，实测覆盖度需达 200× 以上，才能保证每条 sgRNA 都有足够的"备份"。
- 合格指标：① 覆盖度 >95%（实际检测到的 sgRNA 数占参考序列数的比例）；② 均一性 <15（累计分布达 90% 时的 sgRNA 数 / 达 10% 时的 sgRNA 数，比值越接近 1 越均一）。
4. 病毒包装
CRISPR-Screen 需要大量病毒（通常几十个 15 cm 皿），转染试剂用量非常大。PEI 因为便宜、效率稳定，已成为慢病毒包装的金标准。标准三质粒体系：psPAX2（包装）: pMD2.G（包膜）: 文库质粒，质粒与 PEI 按约定质量比混合转染 293T 细胞。包装完成后收毒、测定滴度，即可用于下游感染。
5. 细胞/组织库构建
文库越大，需要的细胞数越多。核心原则是：每个 sgRNA 至少要有 200–500 个细胞"备份"，否则在后续传代过程中，稀有的 sgRNA 会随细胞丢失而消失，直接造成假阴性。
- 以 1000 条 sgRNA 的全基因文库为例，至少需要 2×10⁵ 个被感染的初始细胞；控制 MOI 在 0.5 左右，则需至少 4×10⁵ 个细胞加入对应 MOI 的病毒量。
- 低 MOI 感染的目的是让每个细胞尽量只插入一个 sgRNA，方便后续把表型变化精准归因到单个基因。
- 体内筛选：可将 sgRNA 文库包装进 AAV 等病毒载体，结合组织特异性启动子实现体内、组织特异性的筛选，用于更贴近生理状态的在体功能研究。
6. gDNA 提取与测序文库构建
▍这是最多人好奇的问题：为什么 PCR 要开 15–50 个平行反应？
原因很简单：sgRNA 整合在基因组里，丰度极低。单管 PCR 只能扩增到一部分 sgRNA，多管平行反应合并后才能维持文库覆盖度、避免 PCR 偏倚。这一步本身又拆成三个小步骤：
- Step 1｜gDNA 提取：从细胞沉淀中提取基因组 DNA，根据细胞量选择对应规格的提取试剂盒。
- Step 2｜PCR1：从全基因组中扩增并富集 sgRNA cassette 区域，同时在其末端加上测序接头（P5/P7）。
- Step 3｜PCR2：再加上样本 index（用于区分不同样本）与测序引物结合区。
▍需要特别注意：模板量不是越多越好——每 50 μL 反应最多加约 2.5 μg gDNA，过量反而会导致不同 sgRNA 之间的重组配对错误。另外，sgRNA 在 PCR 前丰度极低、极易交叉污染。
7. 测序与生信分析
数据分析侧，常用 MAGeCK RRA 计算各基因/基因对的 log fold change，并通过 GI score（遗传互作评分） 鉴定合成致死基因对。关键 QC 指标：
- 比对率（mapping rate）>80%
- 缺失/零计数结构 <1%（至多 <5%）
- 生物学重复间相关性 >0.8
- sgRNA 分布 Gini index 越小越均一
低多样性文库（如 sgRNA 数较少）在测序时容易聚焦失败，常规解法有二：① 掺入高多样性样本（如 PhiX）；② 在扩增引物上游引入随机 N 碱基（UMI)提升多样性。若文库本身碱基多样性足够（如 >100 条 sgRNA），通常无需额外 spike PhiX。
基因编辑工具选购指南
| 产品应用 | 产品定位 | 产品名称 | 产品货号 |
| 基础基因编辑 | 野生型SpCas9 | Cas9 Nuclease (10 mg/mL) | 14701ES |
| 低脱靶基因编辑 | 高保真Cas9 | HiFi Cas9 Nuclease (5 mg/mL) | 14704ES |
| 单链切口编辑 | 切刻型Cas9（D10A） | Cas9 D10A Nickase (5 mg/mL) | 14706ES |
| 荧光示踪/流式分选富集 | 带EGFP标签的野生型SpCas9 | NLS-Cas9-EGFP Nuclease (10 mg/mL) | 14707ES |
| 转录调控/染色质免疫沉淀 | 无剪切酶活性的Cas9 | dCas9 Nuclease (10 mg/mL) | 14705ES |
| AI设计高保真基因编辑 | AI设计高保真Cas9类似物 | OpenCRISPR-1 (10 mg/mL) | 14703ES |
| 恒温扩增/核酸检测 | 野生型Cas12a | ArCas12a Nuclease (10 μM) | 14702ES |
| 恒温扩增/核酸检测 | 野生型Cas12b | AapCas12b Nuclease (10 μM) | 14808ES |
| Cas9 sgRNA体外合成 | Cas9 sgRNA合成试剂盒 | Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit | 11355ES |
| 基因编辑效率检测 | 基因编辑效率检测 | T7 Endonuclease I (10 U/µL) | 14548ES |
sgRNA库构建 / 病毒包装 / 核酸提取与 PCR选购指南
| 实验环节 | 翌圣产品 | 货号 |
| sgRNA库构建 | FuniCut 快速内切酶系列 | —— |
| 一步法快速克隆试剂盒 | 10911ES | |
| 凝胶回收试剂盒 | 19101ES | |
| 无内毒素质粒大提V2 | 19037ES | |
| Hieff® LongSeq Plasmid Fragmentation and Ligation Module | 13305 | |
| Hieff® Adapter Ligation Module for ONT | 13304 | |
| 慢病毒包装 | 转染试剂 | 40825ES |
| Polybrene聚凝胺 | 40804ES | |
| 慢病毒包装试剂盒 | 41102ES | |
| gDNA提取与测序文库构建 | 细胞DNA提取试剂盒 | 18700ES/18391ES |
| 长片段多重扩增酶 | 17228ES(一轮扩增) | |
| 高保真DNA文库扩增模块 | 13344ES(二轮扩增) | |
| DNA纯化磁珠 | 12601ES | |
| 即用型dsDNA qubit定量试剂 | 12642ES |
