CRISPR/Cas9是一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，源于细菌和古细菌为应对噬菌体和外源质粒的攻击而演化来的一种获得性免疫防御机制。在现代生物技术研究中，此系统是通过人工优化的具有引导作用的sgRNA (Single Guide RNA)引导核酸酶Cas9蛋白在与sgRNA配对的靶位点处剪切双链DNA，从而引起DNA断裂。由于生物体内非同源末端修复机制或同源重组机制修复DNA，导致基因移码突变、替换或删除，致使基因功能丧失。Hifair^® Precision sgRNA Synthesis Kit采用T7RNA聚合酶混合物高效转录spCas9 sgRNA。本试剂盒含有能被Cas9蛋白识别并起支架作用的特异性序列，该序列的一部分能与使用者设计的目标特异序列部分重叠。退火形成互补链后由DNA聚合酶进行填充。最终生成用于转录的dsDNA模板。本试剂盒利用其提供的试剂和使用者自己设计的特异性DNA序列，单管反应可在4小时内获得20-100μg具有功能的sgRNA。

• 高合成产量：单管反应4小时内sgRNA产量可达20-100 μg；
• 不同种类的sgRNA均可获得高产量；
• 合成的sgRNA条带单一，纯度高；
• sgRNA活性高，可以有效引导Cas9 Nuclease切割靶标DNA。

• 高合成产量：单管反应4小时内sgRNA产量可达20-100 μg

sgRNA的浓度关系到CRISPR/Cas9系统的编辑效果成败，只有加入高浓度的sgRNA方能对基因的编辑起较好效果。翌圣的Hifair^® Precision sgRNA Synthesis Kit可在单管反应4小时内获得20-100 μg的sgRNA，完全满足基因编辑的需要。

图1. 不同时间的sgRNA的合成量

• 不同种类的sgRNA均可获得高产量

一个好的sgRNA Synthesis Kit不仅要能合成高产量的sgRNA，还需适用于各种不同种类的sgRNA合成，方能满足不同类型基因的编辑需要，扩大试剂盒的应用范围。使用翌圣的Hifair^® Precision sgRNA Synthesis Kit同时合成10个不同种类的sgRNA，结果显示翌圣的Hifair^® Precision sgRNA Synthesis Kit可对多个种类的sgRNA进行高产量合成，适应多种基因的编辑需要。

图2. 不同种类的sgRNA的合成产量

• 合成的sgRNA条带单一，纯度高

除了sgRNA的产量，合成的sgRNA的纯度也是影响CRISPR/Cas9系统的编辑的效果的关键因素之一。如果合成的sgRNA的纯度差，易出现脱靶效应。翌圣Hifair^® Precision sgRNA Synthesis Kit合成的sgRNA经过安捷伦2100测定，其条带明显且无杂带，说明sgRNA纯度高。

图3. 合成的sgRNA的品质（安捷伦2100测定）

• sgRNA活性高，可以有效引导Cas9 Nuclease切割靶标DNA

使用翌圣Hifair^® Precision sgRNA Synthesis Kit合成的sgRNA与Cas9 Nuclease组合用于体外切割靶DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测发现所合成的sgRNA可以有效引导Cas9 Nuclease在特定位点切割并产生特定大小的DNA片段。

图4. sgRNA的剪切效率效果图

干冰运输。-20℃保存，有效期两年。

Q：sgRNA 的作用是基于什么原理？

A：在 RNA 编辑的过程中引导尿苷残基插入或缺失到动质体（kinetoplastid）中，属于一种小型非编码RNA，可与 pre-mRNA 配对。

Q：试剂盒提供的组分能直接用于合成sgRNA 吗?

A：试剂盒提供的是基于 T7RNA 聚合酶的转录反应体系，含有能被 Cas9 蛋白识别并起支架作用的特异性序列，该序列的一部分能与使用者设计的目标特异序列部分重叠，退火形成互补链后由DNA 聚合酶进行填充生成用于转录的 dsDNA 模板，使用者需要自己设计的特异性 DNA 序列。