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400-6111-883
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Hifair® T7 High Yield RNA Synthesis Kit
产品货号:10623ES50
产品规格:50 T
产品价格:¥ 1782
类别:RNA合成

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  • 产品信息

    产品名称

    产品编号

    规格

    价格(元)

    促销价(元)

    Hifair® T7 High Yield RNA Synthesis Kit

    10623ES50

    50 T

    1782

    1692

    10623ES60

    100 T

    3382

    3212


    产品描述

    Hifair® T7 High Yield RNA Synthesis Kit进行了转录反应体系的优化,试剂盒使用T7 RNA聚合酶并以含有T7 启动子序列的线型双链DNA为模板,以NTPs为底物,对启动子下游的DNA序列进行转录,高效合成单链RNA转录时可在底物中加入修饰的核苷酸,制备生物素或染料标记的RNA。

    本试剂盒可以合成长转录本以及短转录本,以1 μg的模板投入量可以产生100-200 μg的RNA,转录合成的RNA可用于诸如RNA结构与功能研究、RNA酶保护、探针杂交、RNAi、显微注射及体外翻译等多方面的下游应用。


    产品组分

    编号

    组分

    产品编号/规格

    10623ES50 (50 T)

    10623ES60 (100 T)

    10623-A

    T7 RNA Polymerase Mix

    100 μL

    200 μL

    10623-B

    10×Transcription Buffer

    100 μL

    200 μL

    10623-C

    ATP(100mM)

    100 μL

    200 μL

    10623-D

    CTP(100mM)

    100 μL

    200 μL

    10623-E

    GTP(100mM)

    100 μL

    200 μL

    10623-F

    UTP(100mM)

    100 μL

    200 μL

    10623-G

    Control DNA Template(500ng/μL)

    10 μL

    20 μL


    产品应用

    RNA体外合成 


    运输储存方法

    干冰运输。-20℃保存,有效期两年。


    注意事项

    1. 反应体系中须严格注意不要混入RNase。

    2. 实验器材(如:枪头、产品管等)注意严格使用 RNase Free用品。

    3. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
    4. 本产品仅作科研用途!


    合成原理

    图片.png

    1:RNA体外转录过程

    操作流程

    1.DNA模板制备

    带有双链T7启动子的线性化质粒或PCR扩增产物都可以作为Hifair® T7 High Yield RNA Synthesis Kit 体外转录模板,模板可以用TE缓冲液或Rnase free H2O溶解。

    T7启动子序列: TAATACGACTCACTATAG*GG   (注G*为RNA转录的第一个碱基

    A.质粒模板

    将目的DNA插入含有T7启动子的质粒载体中,然后用限制酶进行处理,待完全线性化后进行纯化。

    注:1. 环状质粒由于没有有效的终止,会转录出不同长度的RNA产物,为了得到特定长度的RNA,质粒必须完全线性化。

    2. 质粒线性化所选限制酶需要在启动子区域右侧、插入DNA片段的下游,且在插入DNA片段中无识别位点。选择的限制酶要能形成5’突出或者平滑末端。

    3. 为了避免蛋白及盐离子等对体系的影响,质粒线性化后建议纯化后再作为模板进行体外转录。

    1600752888599222.png
     2:线性化质粒为模板体外转录过程

    B.PCR产物模板

    T7启动子的PCR产物可以作为体外转录模板。首先将T7启动子序列(TAATACGA CTCACTATAGGG)加在有义链的上游引物的5’端,然后在高保真酶的作用下扩增含T7启动子的DNA模板,随后进行转录。PCR产物可以不经纯化直接作为模板,但纯化后会得到更高的RNA产出。

    注:1. PCR产物作为模板,必须电泳确认产物的特异性及浓度,建议20μL反应体系投入2-5μL PCR产物。

    2. 为了得到更多高品质的RNA,推荐PCR产物胶回收之后再作为模板进行体外转录。

    2.RNA体外转录

    A. 试剂解冻

    T7 RNA Polymerase Mix短暂离心,置于冰上。解冻10×Transcription Buffer和核糖核苷酸(ATP、CTP、GTP、UTP),混匀并离心至管底,10×Transcription Buffer置于室温,4种核糖核苷酸置于冰上,备用。

    B. 室温装配转录反应

    按下列体系配制反应体系

    组分

    体积(μL)

    终浓度

    RNase free H2O

    Up to 20

    -

    10×Transcription Buffer

    2

    CTP / GTP/ ATP/ UTP (100 mM each)

    2 each

    10 mM each

    模板DNA

    1 μg

    -

    T7 RNA Polymerase Mix

    2

    -

    注: 1. 反应于室温配置。由于10×Transcription Buffer中含有亚精胺,低温下亚精胺浓度过高会引起DNA模板沉淀。

    2. 短转录本(<100nt),模板可使用2ug,转录时间增至4-8个小时。

    3. 长转录本(>1000nt),建议使用质粒线性化模板进行转录。

    4. 建议在PCR仪中进行反应,热盖打开,防止长时间导致反应液蒸发。

    5. 反应产物可能有白色沉淀。这是反应过程中游离的焦磷酸与反应液中的镁离子形成焦磷酸镁,不影响后续实验。如想去除,添加EDTA即可消失。添加EDTA如果影响后续实验,也可以离心回收上清。

    6. 使用试剂、容器等无RNase污染。

    C. 37℃孵育2个小时

    将上述反应液混合均匀,短暂离心至管底,37℃孵育2个小时。若转录本长度小于100nt,增加反应时间至4-8个小时。

    D. DNaseⅠ处理(可选)

    反应完成后,每管加入2μL DNaseⅠ(RNase free),37℃孵育15min以去除模板DNA。

    3.产物纯化

    转录后的RNA可以选用RNA Cleaner磁珠进行纯化(货号:12602),也可以采用酚/氯仿纯化法,氯化锂沉淀法或柱纯化等,以去除蛋白、游离的核苷酸。纯化后的RNA经电泳检测后可进行下游实验或存储于-80℃。

    A.RNA Cleaner磁珠纯化法

    提前将RNA clean beads从4 ℃取出,平衡至室温(约30 min),并用RNase free H2O将转录产物稀释至50μL。

    ①颠倒或涡旋振荡使磁珠充分混匀,吸取2×磁珠(100μL)加入RNA样品中(50μL),用移液器吹打6次充分混匀。室温孵育5 min,使RNA结合到磁珠上。

    ②将样品置于磁力架上5 min,待溶液澄清后,小心移除上清。

    ③保持样品置于磁力架上,加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 s,小心移除上清。重复此操作一次。

    (注:漂洗时使用的80%乙醇需要使用RNase free H2O新鲜配制,以防止引入RNase酶导致RNA降解。)

    ④保持样品始终处于磁力架上,开盖空气干燥磁珠5 min。

    (注:磁珠开盖晾干时要避免过分干燥,如果磁珠出现龟裂,则提示磁珠过分干燥,此时RNA的洗脱效率会降低)。

    ⑤将样品从磁力架上取出,加入22μL RNase free H2O,用移液器吹打6次以充分混匀,室温静置5 min。

    ⑥将样品置于磁力架5 min,待溶液澄清后,小心转移上清20μL至一个新的RNase free PCR管中。

    (注:建议转移上清时留2-3μL液体,以免吸到磁珠影响后续实验。得到的RNA极不稳定,建议尽快进入下一步。若要保存,请置于-80℃保存。)

    B.酚/氯仿纯化法

    ①向20μL反应混合物中,加入115μL RNase free H2Ol5μL 3M乙酸钠(pH5.2),混合均匀。

    ②用等体积的酚/氯仿(1:1)抽提一次,再用等体积的氯仿抽提2次,收集上清,并转移至新的RNase free EP管中。

    ③加入2倍体积的无水乙醇沉淀RNA。混合均匀后置于-20℃至少30min,以最大转速,4℃离心15min,收集沉淀。

    ④加入500μL冰预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀。

    ⑤ 20μL RNase free H2O溶解RNA沉淀。纯化后的RNA溶液于-80℃保存。

    C.氯化锂沉淀法

    采用氯化锂沉淀法,RNA长度要大于300nt,且浓度不能低于100ng/μL。

    ①向20μL反应混合物中,加入30μL RNase free H2O30μL7.5M氯化锂。

    ②混合均匀后,置于-20℃至少30min,以最大转速,4℃离心15min,收集沉淀。

    ③加入500μL冰预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀。

    ④ 20μL RNase free H2O溶解RNA沉淀。纯化后的RNA溶液于-80℃保存。

    D.柱纯化法

    纯化前加入80μL RNase free H2O将产物稀释至100μL,再按柱纯化说明书进行纯化。

    4.RNA定量

    A.紫外吸收法

    游离核苷酸会影响定量的准确性,采用此方法前请先进行RNA纯化。然后通过测定产物的A260读数来确定RNA的产量。对于单链RNA,1 A260相当于40µg/mL,所以RNA的产量可以如下计算:  A260 x 稀释倍数 x 40 = µg/mL RNA

    B.染料法

    RiboGreen染料进行RNA定量,游离核苷酸不会影响定量,可以对纯化或未纯化的反应产物中的RNA进行准确定量。

    5.RNA大小及质量检测

    A.琼脂糖电泳法

    为了确定RNA的大小,完整度以及质量,需要进行琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。

    B.Agilent 2100 Bioanalyzer检测法

    2100可以用来评估RNA完整度及质量,它仅需要少量的RNA进行分析,高品质的RNA在电图上应呈现明显且锐利的峰。

    常见问题及解决方案

    1.转录产物产量低

    模板的质量与产量密切相关,实验组产量明显低于对照组可能原因有:①实验模板中有抑制反应成分;②实验模板本身原因。

    建议: ①重新纯化模板;②确定模板定量以及其完整性;③延长反应时间;④加大模板投入量;⑤尝试其它的启动子和RNA聚合酶。

    2.短转录本产量低

    转录起始片段短会抑制反应,转录产物小于100nt时,延长反应时间至4-8小时或增加模板量至2ug可以提高RNA产量。

    3.RNA转录长度大于预期

    如果电泳显示产物条带大于预期大小,可能原因:①质粒模板可能没有完全线性化;②有义链3’端为突出结构;③RNA存在未完全变性的二级结构。

    建议:①检查模板是否完全线性化,如有必要,额外进行线性化;②选择合适的限制性酶,避免产生3’突出端,或者用Klenow Fragment或T4 DNA聚合酶补齐后,再进行转录;③使用变性胶检测RNA产物。

    4.RNA转录长度小于预期

    如果电泳显示产物条带小于预期大小,可能原因:①模板包含类似于T7 RNA聚合酶的终止序列;②模板中GC含量高。

    建议:①降低反应温度(比如,30℃),有时降低温度可以增加转录长度,但会降低产量。或者尝试不同的RNA聚合酶进行转录;②若模板GC含量高,采用42℃进行转录反应,或者添加SSB提高产量及转录长度。

    5.转录产物电泳拖尾

    电泳过程中有拖尾现象,可能原因:①实验操作过程被RNase污染;②DNA模板被RNase污染。

    建议:①实验过程中使用RNase-free的枪头和EP管,佩戴一次性乳胶手套和口罩,所有试剂均用RNase free H2O配制。②重新纯化模板DNA。

    HB200916