您好,欢迎来到上海翊圣生物科技有限公司官方网站!
400-6111-883
| EN
400-6111-883
Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit 一步法快速克隆试剂盒
产品货号:10911ES25
产品规格:25 T
产品价格:¥655.00
类别:一步法快速克隆

说明书下载

  • 产品信息


    产品名称

    货号

    规格

    储存

    价格(元)

    Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit 一步法快速克隆试剂盒

    10911ES25

    25 T

    -20℃

    655.00

    Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit 一步法快速克隆试剂盒

    10911ES62

    5×25 T

    -20℃

    2455.00


    产品描述

    Hieff Clone®Plus One Step Cloning Kit是一款简便、快速、高效的DNA定向克隆产品,该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任何载体的任何位点,可高效克隆50 bp-10 kb片段。将载体线性化,并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的线性化载体末端同源序列,使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下,仅需50℃反应20 min即可进行转化,完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。


    产品组分

    编号

    组分

    产品编号/规格

    10911ES25 (25 T)

    10911ES62 (5×25 T)

    10911-A

    2×Hieff Clone® Enzyme Premix

    250 μL

    5×250 μL

    10911-B

    500 bp Control Insert (25 ng/μL)

    5 μL

    5×5 μL

    10911-C

    pUC 19 Control Vector, linearized (50 ng/μL)

    5 μL

    5×5 μL


    产品应用

    快速克隆;定向克隆;定点突变。


    运输与保存方法

    冰袋运输。-20℃保存,有效期1年。


    实验流程    

                                                                             Z$CPGWM03R(%3@~(O@%UEOD.png              

              


    一. 制备线性化载体

    选择合适的克隆位点,并对载体进行线性化。建议尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。载体克隆位点上下游25 bp区域内GC含量均在40%-60%范围内最佳。线性化载体可通过限制性内切酶酶切或反向PCR扩增获得。

    1.酶切制备线性化载体
    1)双酶切线性化:线性化完全,转化背景低。建议使用。
    2)单酶切线性化:线性化程度较差。可适当延长酶切时间以降低转化背景。
    注:不含插入片段的假阳性克隆是由未线性化环状载体转化而形成的。若这种假阳性克隆比例较高,建议重新制备线性化载体。

    2.反向PCR扩增制备线性化载体

    建议使用高保真聚合酶(如:Hieff Canace® High-Fidelity DNA Polymerase,Cat No. 10135ES)进行载体扩增,以减少扩增突变的引入。PCR扩增模板应尽量使用预线性化质粒,以防止残留环状质粒模板对克隆阳性率的影响。

    Hieff Clone® 重组反应体系兼容几乎所有酶切反应体系和常规PCR反应体系,当载体酶切产物或反向PCR扩增产物纯度较高时,可以无需纯化,直接进行重组反应。但纯度较低且有可能含有未线性化环状质粒时,建议使用高质量的试剂盒对线性化载体进行胶回收纯化,以提高产物纯度并去除一部分未线性化的环状载体,有利于提高重组效率。

    二. PCR扩增制备插入片段

    1.设计扩增引物

    Hieff Clone® 引物设计方式:通过在插入片段正、反向PCR引物的5’端引入15-25 bp(不包括酶切位点)的线性化载体末端同源序列,使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。
    插入片段正向扩增引物设计方式:
    5’—上游载体末端同源序列+酶切位点(可保留或删除)+基因特异性正向扩增引物序列—3’

    插入片段反向扩增引物设计方式:

    3’—基因特异性反向扩增引物序列+酶切位点(可保留或删除)+下游载体末端同源序列—5’

    注:
    ①基因特异性正/反向扩增序列即常规插入片段正/反向扩增引物序列;
    ②上游/下游载体末端同源序列为线性化载体最末端序列(用于同源重组),GC含量40
    %-60%为佳。


    QQ图片20180903130133.pngQQ截图20180903130407.png

     

    2 插入片段引物设计方案

    注:最终引物长度超过40 bp,建议选用PAGE纯化方式进行引物合成。计算扩增引物退火温度时,只需计算基因特异性扩增序列的Tm值,载体末端同源序列不应参与计算,为了得到高效率克隆,建议Tm≥48℃。

    2.插入片段PCR扩增

    插入片段扩增可用任意PCR酶扩增,无需考虑产物末端有无A尾 (重组过程中将被去除,在最终载体中不会出现)。但为了减少扩增突变的引入,建议使用高保真聚合酶进行扩增(Hieff Canace® High-Fidelity DNA Polymerase,Cat No. 10135ES)。

    PCR扩增结束后,取少量产物进行琼脂糖凝胶电泳以检验扩增产量和特异性。Hieff Clone™重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此,如果扩增模板不是与载体抗性相同的环状质粒,且PCR产物电泳条带单一,则扩增产物可以无需纯化,直接用于重组反应。但PCR扩增产物纯度较低时,建议使用高质量的试剂盒对PCR扩增产物进行胶回收纯化,以提高产物纯度,有利于提高重组效率。

    三. 线性化载体与插入片段浓度测定

    推荐使用琼脂糖凝胶电泳比较条带亮度的方法对DNA进行定量。将线性化载体和插入片段扩增产物做数个等体积稀释梯度,原始产物和稀释后产物各取1 μL进行琼脂糖凝胶电泳,与DNA分子量标准(DNA Marker)比较条带亮度以确定其近似浓度。


    四. 重组反应

    1. 线性化载体与插入片段使用量计算

    Hieff Clone® 重组反应体系最适载体使用量为0.03 pmol;最适载体与插入片段摩尔比为1:2-1:3,即最适插入片段使用量为0.06-0.09 pmol。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得:

    最适载体使用量 = [0.02×载体碱基对数]ng (0.03 pmol)

    最适插入片段使用量 = [0.04×插入片段碱基对数]ng (0.06 pmol) 或= [0.06×插入片段碱基对数]ng (0.09 pmol)

    例如,将长度为2 kb的插入片段克隆至长度为5 kb的载体时,载体的最适使用量应为:0.02 × 5000 = 100 ng;插入片段最适使用量应为:0.04 × 2000 = 80 ng或0.06 × 2000=120 ng。

    1)当插入片段长度大于载体时,最适载体与插入片段使用量的计算方式应互换,即插入片段当做载体,载体当做插入片段进行计算。
    2)线性化载体的使用量应在50-200 ng之间;插入片段扩增产物的使用量应在20-200 ng之间。当使用上述公式计算最适使用量超出这个范围时,则选择最低或最高使用量即可。
    3)线性化载体和插入片段扩增产物未纯化,直接使用时,使用总体积应不超过反应体系体积的1/5,如20 μL体系不超过4 μL。


    2.反应体系(推荐冰上配制,各组分使用前需混匀)

    组分

    重组反应

    阴性对照-1

    阴性对照-2

    阳性对照

    ddH2O

    Up to 20 μL

    Up to 20 μL

    Up to 20 μL

    Up to 20 μL

    2×Hieff Clone Enzyme Premix

    10 μL

    0 μL

    0 μL

    10 μL

    线性化载体

    X μL

    X μL

    0 μL

    1 μL

    插入片段

    Y μL

    0 μL

    Y μL

    1 μL

    注:
    1)X和Y分别是根据公式计算得到线性化载体和插入片段用量。

    2)阴性对照-1可用来确认线性化载体有无环状质粒残留,可选择性进行。
    3)当插入片段扩增模板是与载体抗性相同的环状质粒时,可用阴性对照-2来确认有无环状质粒模板残留,可选择性进行。

    4)试剂盒中提供阳性对照反应所需组分,可用来排除其他实验材料及操作因素的影响,可选择性进行。

    3.重组反应

    1)体系配制完成后,用移液器轻轻吸打混匀各组分,短暂离心将反应液收集至管底。
    2)置于50℃反应20 min。当插入片段>5 kb时,可将孵育温度延长至25 min。
    注:建议在PCR仪或水浴锅等温控精确的仪器上进行反应。

    3)待反应完成后,建议将反应管置于冰上冷却5 min,以防温度过高降低感受态转化效率。

    4)反应产物可直接进行转化,也可储存于-20℃,待需要时解冻转化。

    五. 重组产物转化、涂板

    1)在冰上解冻克隆感受态细胞(如:DH5α Chemically Competent Cell,Cat No. 11802ES)。

    2)取10 μL冷却重组产物,加入到100 μL感受态细胞中,轻弹管壁数下混匀,在冰上放置30 min。

    3)42℃热激90秒,冰浴孵育2 min。

    4)加入900 μL SOC或LB培养基,37℃孵育10 min充分复苏。37℃,200 rpm,摇菌45 min。
    5)5000 rpm离心3 min,弃掉900 μL上清。用剩余培养基将菌体重悬,用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀。待菌液被吸收,将平板倒置,于37℃过夜培养。

    六. 克隆鉴定

    最方便快捷的方法是菌落PCR。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至20-50 μL LB培养基中混匀,直接取1 μL作为PCR模板。推荐至少用一条通用测序引物进行菌落PCR,这样可以避免PCR假阳性的产生。后续也可做酶切或测序鉴定。

     


    应用实例

    1.png                              3:Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit可以有效克隆不同长度的单片段基因。

    A-D:重组转化平板。E:插入片段和载体浓度检测电泳图。F-H:插入片段PCR鉴定电泳图。箭头指示目的条带。载体:pFastBac1,4.7 kb,插入片段大小分别是1.2 kb,3 kb和5 kb,载体与插入片段摩尔比:1:3,重组反应条件:50℃,20 min。


    常见问答

    1、最佳克隆位点选择?
           答:在选择克隆位点时,应避免选择克隆位点上下游50 bp内有重复序列的区域。当克隆位点上下游25 bp区域内GC含量均在40%-60%范围内时,重组效率将达到最大。若高于70%或者低于30%,重组效率会受到较大影响。

    2、无克隆长出或克隆数较少?

    答:出现该情况,建议同时使用试剂盒所附带的阳性对照,可排除试剂盒本身的影响,并进行进一步判定,主要有以下可能情况:

    1)引物设计不合适:推荐【同源序列(15-25 bp)+完整的酶切位点+基因特异性扩增引物】,GC含量40% - 60%。

    2)感受态细胞效率低:使用新鲜制备或妥善冻存的感受态细胞,确保其转化效率>107 cfu/μg。每次操作时可设置一组转化质粒的对照实验,以检测感受态细胞的转化效率。选择克隆感受态细胞(如DH5α),不能选择表达感受态细胞。

    3)线性化载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量,或者比例不佳:尽量按照推荐的量和比例配制重组反应体系。

    4)线性化载体和插入片段扩增产物不纯,抑制反应:线性化载体和插入片段扩增产物未纯化,直接使用时,使用总体积应不超过反应体系体积的1/5,如20 μL体系不超过4 μL。建议线性化载体、插入片段扩增产物进行凝胶回收纯化,纯化产物溶解在ddH2O中。

     3、 出现较多假阳性

    答:主要有以下可能情况:

    1)载体线性化不完全:即使是痕量未完全酶切的载体也会产生很高的转化背景。可通过阴性对照检测载体是否线性化完全,优化酶切体系,提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物等都可以有效减少环状质粒残留。

    2)插入片段扩增产物混有非特异扩增产物:建议:①优化PCR体系,提高特异性;②胶回收PCR产物;③鉴定更多克隆。 

    3)反应体系中混入了相同抗性的质粒:PCR扩增模板(载体或插入片段)为环状质粒时,若扩增产物直接用于重组反应,残留环状质粒模板会产生较高的转化背景。建议使用预线性化质粒作为扩增模板、扩增产物进行DpnI消化或扩增产物进行胶回收纯化。

    4、菌落PCR无条带

    答:主要有以下可能情况:

    1)引物不正确:推荐使用载体的通用引物或至少使用一条通用引物进行菌落PCR检测。

    2)PCR体系或程序不合适:没有目的条带也没有空质粒条带,建议优化PCR体系、程序;或者提取质粒,以质粒做模板PCR验证;或者进行酶切验证。

    3)重组失败:没有目的条带,只有空质粒的条带,说明重组不成功,载体线性化不完全,建议优化酶切体系。


    相关产品

    产品名称

    货号

    规格

    促销价(元)

    Hieff Clone™ Plus One Step Cloning Kit 一步法快速克隆试剂盒HOT

    10911ES25/62

    25T/5×25T

    655/2455

    Hieff Clone™ Plus Multi One Step Cloning Kit 多片段一步法快速克隆试剂盒HOT

    10912ES10/50

    10T/5×10T

    457/1967

    Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit 定点突变试剂盒HOT

    11003ES10

    10T

    720

    Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit 多点突变试剂盒HOT

    11004ES10

    10T

    1228

    HB180819