RNA的二级结构如何成为影响逆转录效率
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2026-08-11
在进行RT-qPCR实验过程中，逆转录实验是将RNA信息“逆向”转录为cDNA的关键步骤，属于一个承上启下的实验过程，被广泛应用于基因表达分析、病毒研究和RNA测序等领域。然而，这个看似成熟的流程，实则隐藏着一个容易被忽视却又至关重要的变量——RNA自身的二级结构。
1.什么是RNA二级机构？
由分子内碱基配对形成的局部发夹、茎环乃至更复杂的空间折叠都可以称之为二级结构，其隐秘的地影响着逆转录酶的效率、进程乃至最终的数据。
2.RNA二级结构如何影响着逆转录？
逆转录酶本质上是一种依赖于模板的聚合酶，它需要一个单链且无空间障碍的RNA模板来合成DNA。当RNA分子折叠成紧密的二级结构时，这些结构区域便成了物理屏障，阻碍逆转录酶的推进。
以转运RNA（tRNA）为例，它折叠成稳定的三叶草二级结构和L形三级结构，加之丰富的化学修饰，构成了逆转录过程中极具挑战性的问题。当逆转录酶遇到这些稳定的螺旋区域时，往往会暂停、脱落或发生模板转换，导致cDNA合成提前终止，产生大量截短的产物。这种现象在富含GC、具有复杂二级结构区域的RNA模板中尤为突出。研究显示，RNA二级结构不仅能造成聚合酶在茎区（stem）停顿，甚至当酶解旋通过一个发夹后，RNA会迅速重折叠形成新的结构，再次影响酶的读取效率。
3.遇到复杂的RNA二级结构，应该如何解决？
既然RNA二级结构对逆转录影响如此之大，那么在实际应用中，我们该如何应对？
核心策略之一是选择合适的逆转录酶。不同来源的逆转录酶对RNA二级结构的“攻坚”能力差异显著。近年来，通过蛋白质工程改造的新型逆转录酶显著提升了热稳定性和持续合成能力，能够在较高温度（如50-55℃）下催化反应，从而更有效地“融化”RNA的二级结构，例如翌圣的11155ES逆转录试剂盒，采用升级版Hifair®Ⅲ Reverse Transcriptase，50℃高温逆转，更有利于打开RNA二级结构，提高逆转录效率。
cDNA得率更高，CT值降低
针对不同物种不同GC含量的靶标，表现出更高的cDNA合成效率。针对不同样本的RNA，使用不同反转录试剂按照各自说明书规定的程序进行cDNA合成，后续使用翌圣染料法qPCR试剂进行qPCR。数据表明，相比于其他反转录试剂，11155ES可获得更高的cDNA得率，CT值会更小。
此外，实验操作上的优化也是关键。在逆转录前，将RNA模板与引物在65℃加热5分钟后迅速冷却，可以破坏大部分不稳定的二级结构。
