细胞转染 | 原代胶质母细胞瘤细胞siRNA转染实验方案
实验所用试剂清单
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试剂名称 |
货号 |
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Hieff Trans® LipoBooster 3000 Transfection Reagent Lipo3000转染试剂 |
40801ES |
细胞培养与传代（T25）
润洗：吸弃旧培养基，加入3-4 mL常温PBS轻晃润洗10-20秒后吸弃。
消化：加入1 mL胰酶润湿瓶底，37°C孵育消化。
吹落：待细胞间隙变大、形态变圆时，直接用胰酶轻轻吹打下细胞。
终止：加入2-3 mL完全培养基终止消化，吹打混匀成细胞悬液。
接种：收集悬液，800 xg离心3-5分钟，弃上清，用新鲜培养基重悬后分瓶，补足培养基继续培养。
细胞转染（6孔板为例）
一、 实验前准备
1. 细胞准备： 转染前24小时，用胰酶消化并重悬细胞后，进行细胞计数。以合适的密度将细胞接种于6孔板（或其他规格培养器皿）中，每孔加入2 mL完全培养基。目标是转染时细胞的汇合度达到60% - 80%。
2. 试剂准备：
o siRNA： 合成高质量siRNA，通常设计3个不同siRNA进行验证。
o 转染试剂： 将LipoBooster 3000试剂在4°C冰箱外静置回温，使用前轻轻吹打。
o 无血清培养基： 准备用于稀释DNA和转染试剂的基础培养基（如Opti-MEM）。
二、 转染复合物制备
1. 稀释siRNA： 取一个无菌离心管，加入125 μL的无血清培养基，再加入5uL(20uM)的siRNA溶液，轻轻混匀。
2. 稀释转染试剂： 取另一个无菌离心管，125 μL的无血清培养基，再加入5 μL的LipoBooster 3000转染试剂轻轻吹打混匀。
3. 混合孵育： 将稀释好的siRNA溶液加入稀释的转染试剂管中，轻轻吹打混匀。室温下静置孵育10-15分钟，以形成稳定的DNA-转染试剂复合物。
三、 细胞转染
1. 换液： 转染前，小心吸去细胞原有的培养基，更换为2毫升新鲜预热的完全培养基。
2. 加复合物： 将孵育好的siRNA-转染试剂复合物（总体积约250 μL）逐滴均匀地加入到细胞培养基中，轻轻摇晃培养板使其混匀。
3. 孵育： 将细胞放回37°C、5% CO₂培养箱中培养。
四、 转染后处理
1. 换液： 转染后4-6小时，仔细观察细胞状态。若出现明显毒性，应吸弃含复合物的培养基，更换为2 mL新鲜预热的完全培养基。若细胞状态良好，可以不换液。
2. 检测： 继续培养24-72小时后，根据实验设计（如表达荧光蛋白、检测mRNA或蛋白水平）进行转染效率或功能检测。
小贴士：
1、如果转染后有显著的细胞毒性，可以在6h换液或将增强剂用量减半，可以避免细胞毒性问题；
2、如果转染效率比较低，可以通过提高转染试剂用量，能够有效提高转染效率；
3、稀释质粒和转染试剂，最好使用opti-MEM，效果会优于DMEM；
4、转染试剂兼容血清和双抗，但是稀释质粒和转染试剂用的必须是无血清无双抗培养基。
实验结果分析
在原代胶质母细胞瘤细胞转染siRNA，用翌圣 LipoBooster 3000和进口品牌T2000同时转染，并通过WB检测敲低效率。
数据来源：山东大学齐鲁医院
使用翌圣 LipoBooster 3000和进口品牌T2000同时在原代胶质母细胞瘤细胞P3上转染siRNA，结果显示，翌圣 LipoBooster 3000 转染试剂能够高效转染，显著敲低目的基因表达。
不同培养皿LipoBooster3000转染试剂用量使用指南
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培养容器 |
培养基用量 |
DNA转染 |
siRNA转染（终浓度50 nM） |
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培养基体积 |
复合物中Opti-MEM体积 |
DNA（μg） |
LipoBooster 3000转染试剂（μL） |
Enhancer转染增强剂（μL） |
siRNA体积（初始浓度20 μM） |
LipoBooster 3000转染试剂（μL） |
|
|
96孔 |
100 μL |
2×5 μL |
0.1 |
0.2 |
0.2 |
0.25 μL |
0.3 |
|
48孔 |
250 μL |
2×12.5 μL |
0.25 |
0.5 |
0.5 |
0.625 μL |
0.75 |
|
24孔 |
500 μL |
2×25 μL |
0.5 |
1 |
1 |
1.25 μL |
1.5 |
|
12孔 |
1 mL |
2×50 μL |
1 |
2 |
2 |
2.5 μL |
3 |
|
6孔 |
2 mL |
2×125 μL |
2.5 |
5 |
5 |
5 μL |
7.5 |
|
60 mm |
5 mL |
2×250 μL |
5-10 |
10-20 |
10-20 |
12.5 μL |
20 |
|
10 cm |
10 mL |
2×500 μL |
15-25 |
30-50 |
30-50 |
25 μL |
40 |
|
T25 |
6 mL |
2×250 μL |
6-12 |
12-24 |
12-24 |
15 μL |
24 |
|
T75 |
15 mL |
2×750 μL |
20-40 |
40-80 |
40-80 |
37.5 μL |
60 |
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