实验所用转染试剂

试剂名称	货号
Hieff Trans® LipoBooster 3000 Transfection Reagent Lipo3000转染试剂	40801ES

细胞培养与传代（T25）

润洗：吸弃旧培养基，加入3-4 mL常温PBS轻晃润洗10-20秒后吸弃。

消化：加入1 mL胰酶润湿瓶底，37°C孵育消化。

吹落：待细胞间隙变大、形态变圆时，直接用胰酶轻轻吹打下细胞。

终止：加入2-3 mL完全培养基终止消化，吹打混匀成细胞悬液。

接种：收集悬液，800 xg离心3-5分钟，弃上清，用新鲜培养基重悬后分瓶，补足培养基继续培养。

细胞转染（6孔板）

一、 实验前准备

1. 细胞准备： 转染前24小时，用胰酶消化并重悬细胞后，进行细胞计数。以合适的密度将细胞接种于6孔板（或其他规格培养器皿）中，每孔加入2 mL完全培养基。目标是转染时细胞的汇合度达到60% - 80%。

2. 试剂准备：

o 质粒DNA： 使用高纯度（如试剂盒提取）的质粒DNA，质粒浓度最好高于1000 ng/μL。

o 转染试剂： 将LipoBooster 3000试剂在4°C冰箱外静置回温，使用前轻轻吹打。

o 无血清培养基： 准备用于稀释DNA和转染试剂的基础培养基（如Opti-MEM）。

二、 转染复合物制备

1. 稀释DNA： 取一个无菌离心管，加入125 μL的无血清培养基，再加入2.5 μg质粒DNA，轻轻混匀。然后再加入5 μL的Enhancer增强剂，吹打混匀，获得稀释的质粒DNA溶液。

2. 稀释转染试剂： 取另一个无菌离心管，125 μL的无血清培养基，再加入5 μL的LipoBooster 3000转染试剂轻轻吹打混匀。

3. 混合孵育： 将稀释好的DNA溶液加入稀释的转染试剂管中，轻轻吹打混匀。室温下静置孵育10-15分钟，以形成稳定的DNA-转染试剂复合物。

三、 细胞转染

1. 换液： 转染前，小心吸去细胞原有的培养基，更换为2毫升新鲜预热的完全培养基。

2. 加复合物： 将孵育好的DNA-转染试剂复合物（总体积约250 μL）逐滴均匀地加入到细胞培养基中，轻轻摇晃培养板使其混匀。

3. 孵育： 将细胞放回37°C、5% CO₂培养箱中培养。

四、 转染后处理

1. 换液： 转染后4-6小时，仔细观察细胞状态。若出现明显毒性，应吸弃含复合物的培养基，更换为2 mL新鲜预热的完全培养基。若细胞状态良好，可以不换液。

2. 检测： 继续培养24-72小时后，根据实验设计（如表达荧光蛋白、检测mRNA或蛋白水平）进行转染效率或功能检测。

小贴士：

1、如果转染后有显著的细胞毒性，可以在6h换液或将增强剂用量减半，可以避免细胞毒性问题；

2、如果转染效率比较低，可以通过提高转染试剂用量，能够有效提高转染效率；

3、稀释质粒和转染试剂，最好使用opti-MEM，效果会优于DMEM；

4、转染试剂兼容血清和双抗，但是稀释质粒和转染试剂用的必须是无血清无双抗培养基。

实验结果分析

在原代人皮肤成纤维细胞上转染带有荧光标签的质粒48 h后，通过荧光显微镜评估转染效率。

数据来源：复旦大学附属中山医院

使用翌圣 LipoBooster 3000转染试剂在原代人皮肤成纤维细胞转染质粒DNA，转染效率大约70%，能够实现高效转染。

 

不同培养皿LipoBooster3000转染试剂用量使用指南

 

培养容器	培养基用量		DNA转染			siRNA转染（终浓度50 nM）
	培养基体积	复合物中Opti-MEM体积	DNA（μg）	LipoBooster 3000转染试剂（μL）	Enhancer转染增强剂（μL）	siRNA体积（初始浓度20 μM）	LipoBooster 3000转染试剂（μL）
96孔	100 μL	2×5 μL	0.1	0.2	0.2	0.25 μL	0.3
48孔	250 μL	2×12.5 μL	0.25	0.5	0.5	0.625 μL	0.75
24孔	500 μL	2×25 μL	0.5	1	1	1.25 μL	1.5
12孔	1 mL	2×50 μL	1	2	2	2.5 μL	3
6孔	2 mL	2×125 μL	2.5	5	5	5 μL	7.5
60 mm	5 mL	2×250 μL	5-10	10-20	10-20	12.5 μL	20
10 cm	10 mL	2×500 μL	15-25	30-50	30-50	25 μL	40
T25	6 mL	2×250 μL	6-12	12-24	12-24	15 μL	24
T75	15 mL	2×750 μL	20-40	40-80	40-80	37.5 μL	60

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