研究背景

昼夜节律广泛存在于地球上的生物体中，在生物体响应环境的昼夜变化、维持生理稳态和健康中发挥着重要作用。昼夜节律紊乱可能会引发睡眠障碍、免疫力下降等疾病，威胁到人类健康。

在20世纪90年代，研究发现并提出，在昼夜节律的分子机制中，生物钟（circadian clock）扮演着极其关键的角色。生物钟是生物体内调控生理和行为节律（约24小时周期）的核心机制，它通过转录-翻译负反馈环路（transcription–translation feedback loop，TTFL）的形式实现计时功能，此分子机制在真核生物中高度保守。

TTFL的主要机制包含以下几点

（1）转录因子与DNA启动子区域的顺式元件结合，激活靶基因（包括自身抑制因子）的表达；

（2）抑制蛋白在胞质中积累并转位至细胞核；

（3）核内抑制蛋白与转录因子相互作用，抑制其自身转录，形成约24小时的周期性振荡。

这种TTFL模型，在多种真核生物钟系统中具有普遍适用性。但随着研究的深入，发现该TTFL模型面临诸多挑战：①虽然该TTFL模型机制在真菌、植物和动物等不同物种中表现出相似的结构特征（结构保守），但分子组成成分缺乏同源性（独立进化），暗示可能来源于不同的起源。②转录和翻译过程需要消耗细胞约75%的能量，TTFL模型如何克服能量代谢障碍来维持高度有序的昼夜节律振荡，目前还没有解释清楚。因此，研究试图寻找并解释真核生物钟的分子机制，并探究真核生物与原核生物钟的潜在共同特征。

研究目的

为研究真核生物钟的分子机制，清华大学生物医学交叉研究院张二荃团队课题组于2025年3月26日在国际顶尖学术期刊《Nature》（IF：50.5）上在线发表题为“The P-loop NTPase RUVBL2 is a conserved clock component across eukaryotes”的文章。

图1.文章截图（论文链接：doi.org/10.1038/s41586-025-08797-3）

文章首次揭示了P-loop NTP酶家族成员（AAA+（ATPases Associated with diverse cellular Activities））RUVBL2（又名RuvB-like 2）是真核生物中保守的时钟成分，是真核生物钟的共同核心成分，阐述了RUVBL2通过能量依赖的NTP酶活性调控生物钟的分子机制，并证实了其在真核生物昼夜节律系统中具有进化保守的核心调控功能。与蓝藻生物钟核心蛋白KaiC类似，RUVBL2表现出独特而稳定的低活性ATP酶特性，其催化效率（约13个ATP分子/天），较常规ATP酶（10³-10⁷个ATP分子/天）显著降低。这一发现也支持了最初在蓝藻中发现的“缓慢ATP酶活性是生物钟共同特征”的这一观点。

图2.循环振荡系统的起源模型。该示意图显示了所研究的每个生物体的起源，起源于最后一个普遍共同祖先（LUCA）。周期长度受KaiC或RUVBL ATP酶活性的调节（论文链接：doi.org/10.1038/s41586-025-08797-3）

研究创新点

提出全新假设：在远古生命起源阶段，随着原始生物钟的出现，低活性的 P-loop ATP 酶成为生物钟系统的核心组件。在蓝藻中，KaiC 结合 KaiA 和 KaiB 组成了一个连接到 TTFL 的强大振荡器，而在真核生物中，含有 P 环的 AAA+ ATP 酶 RUVBL2 及其同源蛋白通过与 TTFL 生物钟蛋白相互作用，参与生物钟调控。KaiC 和 RUVBL2 极低的 ATP 酶活性共同决定了生物钟的 24 小时节律振荡，这一机制或许是生物钟系统进化的共同特征。研究团队并对这一假设进行一系列的实验设计和论证。

01

突破传统TTFL模型

传统生物钟研究聚焦于转录调控，而本研究揭示了AAA+ ATP酶通过能量依赖的分子伴侣功能调控时钟蛋白复合物动态，扩展了生物钟调控的分子机制。

02

进化保守性的新证据

RUVBL2在真核生物中的广泛保守性表明，能量代谢与生物钟的偶联可能是一种古老且普适的调控策略，为研究生物钟起源提供了线索。

03

疾病关联的潜在靶点

RUVBL2在癌症和神经退行性疾病中异常表达，其与生物钟的关联可能为相关疾病的昼夜节律失调提供机制解释（如化疗时间优化或睡眠障碍治疗等）。

研究要点

01

RUVBL2是跨真核生物的生物钟保守组分

通过多物种（哺乳动物（小鼠成纤维细胞）、果蝇、植物（拟南芥）等）基因敲除实验，发现RUVBL2缺失导致昼夜节律周期紊乱（如小鼠成纤维细胞周期延长、果蝇运动节律异常等）。
果蝇行为学实验（监测运动节律）和植物开花时间分析，验证跨物种表型保守性。系统进化分析表明，RUVBL2在真核生物中高度保守，提示其功能在生物钟调控中的古老起源以及进化上的高度保守性。

02

RUVBL2通过NTP酶活性调控生物钟

突变的RUVBL2（ATPase活性缺陷型）无法恢复敲除细胞的节律异常，表明其依赖NTP水解的酶活性对生物钟功能至关重要。
进一步研究发现，RUVBL2通过结合并水解ATP/GTP，调控核心时钟蛋白（如CLOCK/BMAL1或同源蛋白）的构象变化，影响其转录活性。

03

RUVBL2与生物钟核心复合物的互作机制

免疫共沉淀（Co-IP）与蛋白质组学分析显示，RUVBL2与生物钟核心复合物（如CLOCK/BMAL1、PER/CRY）存在物理相互作用。
染色质免疫沉淀（ChIP）分析RUVBL2对CLOCK/BMAL1靶基因（如Per、Cry）启动子结合的调控，RUVBL2通过维持时钟蛋白复合物的动态组装（如促进PER/CRY降解或CLOCK/BMAL1的激活），直接调控TTFL的周期性振荡。

04

能量代谢与生物钟的偶联

RUVBL2的NTP酶活性可能作为细胞内能量状态的传感器，将代谢信号（如ATP/ADP比率）与生物钟调控偶联，解释生物钟如何响应营养或能量胁迫。

总结

研究团队通过系统性遗传筛选，获得了RUVBL2的三种功能突变体：节律紊乱型、周期缩短型、周期延长型。将这些突变体通过腺相关病毒载体递送至小鼠视交叉上核（SCN）后，可显著改变其自主运动活动的昼夜节律模式。

生化分析证实这些表型变异均与ATP酶活性改变直接相关。酶动力学分析表明，野生型RUVBL2的ATP水解活性极低，每日仅催化约13个ATP分子水解，其周转率较典型ATP酶显著降低。

RUVBL2 作为保守的低活性 ATP 酶，在调控真核生物钟周期方面发挥了关键作用，在人类、果蝇和真菌等不同真核生物钟系统中均得到验证：①RUVBL2直系同源物与各物种核心时钟蛋白存在保守的物理相互作用；②跨物种的RUVBL2突变均导致一致的节律表型。

使用抗癌药物 CB-6644 抑制 RUVBL2 活性，可剂量依赖性延长昼夜周期，为新型生物钟调节剂的开发提供新的方向。

综上所述，该研究不仅确立了RUVBL2在真核生物昼夜节律系统中的核心地位，证实了 RUVBL2 作为核心生物钟组分的作用，也首次揭示了慢速ATP酶活性这一最初在蓝藻时钟中发现的特征性机制，如何以类似 KaiC 的机制调节真核生物的昼夜节律，首次证实了其在真核生物中同样具有进化保守性，为理解生物钟的分子进化提供了新视角。

这一发现丰富了真核生物钟的分子调节机制，深化了对生物钟能量耦合机制的理解，也为靶向昼夜节律紊乱的干预策略提供了新思路，在进化生物学和生物钟研究领域具有重要意义。

翌圣助力产品

在该研究中，研究团队使用了翌圣生物Hygromycin B 潮霉素B（60225ES）进行细胞转染和筛选：

实验步骤

01

质粒构建

将野生型或突变的同源基因组克隆至携带潮霉素B抗性（# 60225ES，Yeasen Biotechnology）的PBS质粒中，该质粒携带潮霉素B基因，用于后续筛选。

02

电穿孔转化

分生孢子（Conidia）制备：收集Ku70菌株的分生孢子（无性生殖孢子，易于遗传操作）。
电穿孔转化：通过Gene Pulser Xcell电穿孔系统施加高压电脉冲，使孢子细胞膜暂时形成孔洞，允许外源质粒DNA进入细胞。使用Gene Pulser Xcell全功能电转仪系统（Bio-Rad），将Ku70的分生孢子分别用野生型或突变型基因盒进行转化，并接种于含潮霉素B的琼脂平板上。
转化后处理：将孢子涂布在含潮霉素B的琼脂平板上，仅成功整合质粒（携带潮霉素抗性基因）的孢子能够生长。

03

筛选与验证

初筛（5天培养）：30°C黑暗条件下培养5天，筛选出潮霉素抗性菌落。在30℃黑暗条件下培养5天后，挑取单菌落至含潮霉素B的斜面培养基进行基因型鉴定。随后筛选出靶向突变株系，接种于race tube（节律检测管）进行生物节律检测。
将race tube置于25℃持续光照条件下培养24小时，直至观察到均匀生长前沿（形成均匀生长带）。①对于持续黑暗（DD）条件，将race tube置于黑暗环境中培养数日，研究内源性生物钟驱动的自主节律；②对于光暗交替（LD）条件，采用12小时光照/12小时黑暗的循环模式培养数日，模拟昼夜交替；③对于温度循环条件，在持续黑暗环境下以25℃12小时/30℃12小时的温度周期培养数日，研究温度对生物钟的影响。按时记录实验数据，使用ImageJ（v.1.53c）软件分析并计算节律周期，评估RUVB2 S79I突变对生物钟的影响。

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