免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）是一种实验技术，用于检测组织切片中特定抗原（通常是蛋白质）的存在和定位。该技术广泛应用于医学研究、病理诊断和生物学研究中。

IHC的基本原理是利用抗原-抗体反应的特异性。抗体是能够特异性识别和结合抗原的蛋白质。当抗体与组织切片中的相应抗原结合后，通过检测抗体上的标记物（如酶、荧光染料或金属颗粒）的信号，可以在显微镜下观察到抗原的位置和表达水平。

翌圣生物IHC全系列产品为您的IHC实验保驾护航，助您获取文献级IHC图像的旅途一帆风顺。今天，小翌带您详细了解下我们为您的IHC实验中关键步骤所准备的试剂及注意点，助您完美躲坑。

同时我司提供免疫荧光全流程解决方案。

 

 

组织固定和切片

实验常用的固定剂有可溶性溶剂和交联剂两大类。可溶性溶剂：例如丙酮、乙醇等，可去除脂类物质，实现细胞脱水，同时将蛋白质沉淀并固定于细胞结构上，这类试剂对抗原免疫活性保护较好，可溶解膜磷脂，无需额外通透。交联剂：例如多聚甲醛等，可通过生物分子的自由氨基基团实现桥联作用，将各类生物分子交联起来，构建成相互连接的抗原网络，这类试剂对脂肪和脂类物质保存良好，能使组织硬化并提升其弹性，为后续的切片操作提供便利。合适的固定剂需根据靶抗原特性和所需的检测技术进行选择。

注：在制作石蜡切片样本时，必须在石蜡包埋前，对组织进行固定，需注意固定时间最好不超过24小时，否则容易导致抗原被掩蔽。冰冻样本的固定在切片之后，通常用甲醇或乙醇进行固定，由于醇类固定剂对表位掩蔽作用较弱，因此无需抗原修复。

靶抗原	固定剂推荐
大多数低分子量的蛋白质、肽和酶	细胞样本：4% 甲醛 组织切片：10% 中性福尔马林（NBF）
精细组织（如睾丸组织和眼组织）	Bouin 固定剂
小分子（如氨基酸）	4% 甲醛
免疫球蛋白、病毒包涵体、骨骼肌横纹组织	Zenker 溶液
白细胞颗粒、造血器官、结缔组织	Helly 溶液
RNA或DNA	Carnoy 溶液
大分子蛋白抗原（如免疫球蛋白）	冰冷丙酮或甲醇(100%)
细胞核和细胞质	福尔马林锌固定液
电子显微镜检测用样本	4% 甲醛-1% 戊二醛

实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复。冰冻切片是一种通过液氮，异戊烷或干冰让组织在低温条件下快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法，因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。

产品详情

产品编	产品码名称	规格
36309ES	OCT冰冻切片包埋剂（进口原料）	118 mL
36324ES	OCT冰冻切片包埋剂	120 mL
41403ES	PBS (1×) 细胞培养级	500 mL
41404ES	PBS(10×) 细胞培养级	500 mL
60536ES	4%多聚甲醛固定液	100 mL/500 mL
60535ES	10%中性福尔马林溶液	100 mL/500 mL
60715ES	Poly-D-lysine 多聚-D-赖氨酸 (分子量:150000-300000)	5 mg/10 mg/50 mg
60716ES	Poly-L-lysine 多聚-L-赖氨酸 (分子量:150000-300000)	5 mg/10 mg/50 mg

 

烤片、脱蜡及水化

将切片放置与56~60℃的恒温箱中2~6小时，将带有蜡的组织切片牢固的黏在载玻片上，一面染色过程中切片脱落。使用二甲苯浸泡样品，脱掉组织中的蜡，但是由于进入组织中的二甲苯不能与水溶性染色液相容，需要使用梯度的乙醇将组织中的二甲苯逐步替代出来。

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抗原修复

细胞或组织用多聚甲醛、甲醛或其它醛类试剂固定后，会导致蛋白之间的交联(cross-link)，从而遮蔽样品的抗原位点，导致免疫染色时染色信号减弱，甚至出现一些假阳性染色结果。很多抗原的可视性可以通过抗原修复来提高，抗原修复可以打破福尔马林固定时形成的蛋白质交联，从而使被掩藏的抗原显现出。

抗原修复主要分为两种方法：酶/蛋白水解诱导抗原修复(PIER)和热诱导抗原修复(HIER)。PIER利用胰蛋白酶、蛋白酶K，通过蛋白酶的化学反应来修复蛋白交联，适合较难修复的抗原表位。HIER利用加热和加压来修复抗原表位，修复过程更温和。

 

小翌推荐使用柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法，其效果优于微波修复发和直接煮沸修复法，使得免疫组化结果更加可靠。

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细胞膜打孔

当目标抗原位于细胞内部时，为了使抗体能够进入细胞内部，必须通过通透液暂时破坏细胞膜的完整性，使其变得通透。使用通透液有助于暴露抗原、核酸等作用靶点，使抗体、探针或标记物等更容易进入细胞内，从而确保染色等的检测效果。

 

应用场景	透化溶剂	使用方法
胞外表位	无需透化
胞内表位	Tween-20或Digitonin洋地黄皂苷	配制终浓度为0.2%至0.5%的溶液 作用10-30分钟
有膜细胞器内的表位	Triton X-100或NP-40	在PBS中配制终浓度为0.1%至0.2%的溶液 作用10分钟

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阻断内源性酶活性

内源性过氧化物酶：内源性过氧化物酶广泛存在于一些细胞和组织中，包括血红细胞、肾脏和肝脏组织等。从而导致利用过氧化物酶的方法进行样品检测时会出现较高的背景，甚至出现假阳性结果。因此，细胞或组织样品等在染色前宜使用适当的过氧化物酶封闭液进行封闭，以消除内源性过氧化物酶的干扰。

内源性生物素：内源性生物素在多种细胞类型的细胞溶质和线粒体中作为酶辅因子发挥作用，在使用生物素检测系统之前，建议向样本中加入过量的亲和素，以结合样本中内源性生物素，随后再使用过量的生物素孵育，达到封闭亲和素分子上额外的结合位点。

内源性碱性磷酸酶：内源性碱性磷酸酶在各类组织与细胞中均有广泛分布，且该酶在冰冻组织中的活性通常更高。例如，肠道组织的小肠上皮细胞可表达肠碱性磷酸酶和人胎盘组织的胎盘细胞微绒毛能合成人胎盘碱性磷酸酶等。做细胞涂片时，中性分叶核粒细胞、中性杆状核粒细胞与中性晚幼粒细胞中均可检测到内源性碱性磷酸酶。如果使用内源性碱性磷酸酶（AP）进行检测，可以将样本与BCIP/NBT一起孵育，确定样本中是否含有内源性AP。如果样本变成蓝色，则表明存在内源性AP，需要封闭：与碱性磷酸酶抑制剂（如盐酸左旋咪唑或盐酸四咪唑）一起孵育可以实现封闭。

 

产品详情

货号	名称	使用场景
36322ES	内源性过氧化物酶封闭液	封闭内源性过氧化物酶
35101ES	链霉亲和素（5mg/mL）	封闭内源性生物素
35102ES	DyLight 405 标记链霉亲和素
35103ES	YSFluor™ 488标记链霉亲和素
35104ES	YSFluor™ 488标记链霉亲和素
35105ES	HRP Streptavidin 辣根过氧化物酶标记链霉亲和素
35106ES	碱性磷酸酶标记链霉亲和素
35107ES	YSFluor™ 594标记链霉亲和素
35108ES	Cy3标记链霉亲和素
35099ES	链霉亲和素（冻干粉）
56010ES	盐酸四咪唑	封闭内源性碱性磷酸酶
54380ES	盐酸左旋咪唑

 

背景封闭

抗体能被组织切片中富有电荷的胶原和结缔组织成分吸附，从而导致背景着色，为了防止这种现象发生,最好在特异性抗体处理切片之前进行封闭，来降低背景染色和假阳性染色。我司给您准备好了各种动物的正常血清以及即用型封闭液。若选择使用血清为封闭试剂，小翌建议使用与二抗种属相匹配的血清，防止检测到非特异性结合位点，若选择使用BSA、酪蛋白或翌圣免疫染色封闭液，则不必考虑与二抗的种属匹配问题。

产品详情

货号	名称	规格
36116ES	Normal donkey serum 正常驴血清	10 mL
36117ES	Normal rabbit serum 正常兔血清	5 mL
36118ES	Normal mouse serum正常小鼠血清	5 mL
36119ES	Normal goat serum 正常山羊血清	10 mL
36320ES	Immunostaining Blocking Buffer 免疫染色封闭液	100 mL/500 mL

 

 

抗原抗体结合

抗体的选择，选择已通过验证可用于免疫组化（IHC）应用的一抗，来识别靶点；即可选择直接带有偶联物的一抗（直接检测）又可以利用普通的一抗识别靶点，然后再利用带有偶联物的二抗进行识别一抗（间接检测）。

选择抗体需要确认一下重要信息。

一抗：

1. Antigen（抗原名称）：英文全称、简称都提供, 中文最好也提供

2. Reactivity（反应性）：实验用于什么物种, 是人, 大鼠还是小鼠等

3. Applications（应用）：已通过验证可用于免疫组化（IHC）。

产品详情

表格仅展示部分，详情请查阅翌圣官网产品中心。

二抗：

1. Host（一抗名称，种属来源）

2. Conjugate（标记物）：抗体是酶标记还是荧光标记，还是其他。

另外小翌还为您准备了免疫组化笔（Cat#36310），可帮您在不影响实验结果的前提下有效减少抗原抗体的使用量，并避免表面试剂流失造成的干片、脱片。

若您使用的是生物素标记的二抗，还需要添加辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（HRP-Streptavidin）后再显色。

 

产品详情

更多抗体产品欢迎进入官网选购：二抗选择指南

 

显色

显色是免疫组化染色的最后关键步骤，小翌给您准备了4款不同颜色的显示试剂盒，适用于不同显色系统，给您的图像标上您想要的颜色。 

产品详情

 

 

复染及封片

为使组织切片清晰的显示组织结构，便于准确定位，常对切片进行复染，最常使用的细胞核染料为苏木精。最后使用封片剂保存您的辛苦劳作，DAB染色最后使用中性树脂封固，如果选用AEC染色，最后通常使用水性封片剂封片。

产品详情

 

以上就是IHC实验的全流程攻略啦，小翌还想偷偷告诉您，为了让您有更好的操作体验，我们为您准备了免疫组化试剂盒，包含以上操作所需的所有试剂（您只需准备好您要检测的一抗即可），让您的实验不仅结果好，而且省心。

产品详情

货号	名称	规格
36311ES	Immunohischemistry Kit for Mouse Primary Antibody 小鼠免疫组化(IHC)检测试剂盒​	100T
36312ES	Immunohischemistry Kit for Rabbit Primary Antibody 兔免疫组化(IHC)检测试剂盒	100T

 

 

免疫组化常见问题及解决方案

问题	可能原因	方案建议
染色结果呈阴性、免疫组化染色弱	抗体来源选择错误	请确保一/二抗来源的种属为相同。
	组织切片本身不存在目的蛋白	可通过 The Human Protein Atlas 数据库或 UniProt数据库查询目的蛋白在细胞或组织中的表达情况
	抗体浓度和质量问题	提高抗体工作浓度或延长孵育时间；确认抗体可进行IHC实验，通过非IHC实验排除抗体质量问题。
	脱蜡不完全	可根据切片上是否存在透明颗粒，判断是否存在脱蜡不完全，若存在，需延长脱蜡时间或换用新的二甲苯。
	抗原位点被破坏/组织结构硬化交联	优化固定体系，缩短固定时间
	抗原修复不完全	对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，可优化修复方法和修复液pH值并延长修复时间。
	细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应	可加入组织透化步骤，进行细胞膜或核膜的透化。
	封闭时间过长	若使用封闭液进行封闭，请排除封闭液对抗原抗体结合的影响。
高背景染色	交叉反应	换高特异性抗体、筛选抗体亚型
	一/二抗浓度过高	对抗体进行滴定以确定获得特异性反应的最佳浓度。
	显色过度	缩短显色试剂DAB孵育时间。
	洗涤不充分	适当增加抗体孵育后的浸洗次数和浸洗时间；洗涤剂中添加0.1% Tween-20
	封闭不完全	延长封闭时间；优化封闭剂种类；提高封闭剂浓度
	切片或细胞过于干燥或孵育温度过高	实验过程中请保持切片处于湿润状态，一抗孵育时尽量使用4℃过夜孵育。
	内源性过氧化物酶残余	使用新配制的内源性过氧化物酶阻断剂，并适度延长阻断时间。
非特异性染色	抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加非特异性染色	减少抗体孵育时间、降低抗体浓度
	（红细胞、结缔组织）内源性过氧化物酶残余	组织取材后、切片前，用灌注液冲净组织内部的血液和细胞液；适度延长内源性过氧化物酶阻断剂阻断时间；优化封闭剂种类和浓度；在二抗孵育前增加封闭步骤
	一抗导致的非特异性染色	多克隆抗体易于产生非特异性染色，结合抗体官网信息合理选择多克隆抗体或单克隆抗体。
	（免疫细胞）一抗种属来源与组织样本来源相同	如使用鼠源一抗检测小鼠组织，尽量选择种属来源与样本种属不同的一抗；采用一抗同源的免疫球蛋白或F(ab’)₂片段进行预封闭处理；设置阴性对照，实现特异性信号与背景的有效区分。
	切片或细胞过于干燥	实验过程中，需保持样本的湿润。
	（细胞核）苏木素核染过度或浸入分化液时间过短	缩短苏木素染色时长并延长分化和反蓝时间
阳性染色细胞定位不正确	抗原修复条件不合理	尝试改变抗原修复条件。
	固定方法不合理	可能由于不合理或不及时的固定导致抗原破坏，出现抗原弥散的现象，可尝试不同的固定剂或增加固定时间。
	离子相互作用影响抗原识别	尝试调整抗体稀释液的 pH 值或阳离子浓度。
切片边缘着色	试剂未完全覆盖样本	边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心高而致染色深。免疫组化笔画圈应距组织边缘大于3～4 mm，试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2 mm。
斑块状着色	组织局部干燥/试剂孵育不均匀	湿盒孵育，且保证试剂充足，可完全覆盖组织样本
	洗涤不充分	适当增加浸洗次数和浸洗时间
棕色颗粒状沉淀	DAB沉淀	使用新配制的DAB染色并缩短染色时间

 

 

FAQ

Q1:石蜡切片已经放置一年，还可以用来做免疫组化吗？

A1:若放置超过半年，则不建议使用，存在抗原丢失导致结果假阴性或假阳性的可能。

 

Q2:我该如何选择宿主种属培养一抗？

A2:通常情况下，应该选择不同于样本种属的宿主种属培养一抗，防止与组织中的内源性免疫球蛋白发生交叉反应。

 

Q3:如何减少自发荧光？

A3: 1.使用冰冻切片2.如必须制作石蜡切片，建议使用非醛类固定剂，如Carnoy溶液，福尔马林等醛类固定剂会与胺反应产生荧光3.使用硼氢化钠或甘氨酸/赖氨酸阻断醛类物质4.使用淬灭染料（如滂胺天蓝、苏丹黑、台盼蓝或FITC封闭液）处理组织5.针对石蜡切片，黄素和卟啉等荧光化合物，可在固定、脱水时所使用的溶剂从组织中提取这些化合物。

 

Q4:如何验证抗体对目的蛋白/表位的特异性？

A4:若染色图谱与对照细胞/组织中靶蛋白的已知定位特征相符，即可佐证该抗体具备特异性。利用BLAST等序列比对工具，将免疫原序列与其他蛋白序列进行比对，可初步提示抗体的特异性，但该方法的结果并非绝对可靠。而验证抗体特异性的最可靠的方法是在靶蛋白敲除的细胞/组织样本中检测不到特异性染色信号。

 

Q5:使用小鼠抗体需要注意什么？

A5:抗小鼠二抗与内源性小鼠IgG和Fc受体结合，会发生高背景，建议使用F(ab)片段降低背景染色。

 

Q5:我该选择之间检测法还是间接检测法？

A5:直接检测法仅适用于高表达的抗原，该方法无需额外孵育步骤，缩减实验时间，同时有效避免二抗引发的背景染色问题。间接检测法适用于所有抗原，且能实现信号进一步放大，但该方法步骤繁琐，需要额外的封闭步骤和相应对照。

 

Q6:不同生产类型的抗体对我的IHC实验会有影响吗？

A6:抗体有3种生产方法：血清纯化的多克隆抗体、杂交瘤来源的单克隆抗体和重组抗体。

1.若需强信号输出，检测天然构象抗原或表位暴露不充分的样本，可选血清纯化多抗，重点做好批次验证和封闭步骤；

2.若为常规IHC定性/定位检测，追求低背景和高性价比，杂交瘤来源的单克隆抗体是优选；

3.若为标准化批量检测、跨批次对比实验，或对结果稳定性要求极高的IHC研究，重组抗体是最优选择。