二代NGS酶法转化甲基化建库所需酶类及作用

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2026-11-09

DNA甲基化（5mC/5hmC）是表观遗传核心标记，广泛用于肿瘤液体活检、胚胎发育、FFPE临床样本、衰老表观时钟等研究。传统重亚硫酸盐测序（BS-seq/WGBS）依靠强酸强碱化学转化，存在DNA大量降解、GC覆盖偏倚、微量样本建库失败率高等痛点；以EM-seq、TAPS（eTAPS）为代表的酶法转化甲基化建库，采用温和酶促反应替代剧烈化学处理，大幅保留DNA完整性，适配cfDNA、降解FFPE、微量穿刺样本等珍贵临床材料，已成为低起始量甲基化测序主流方案。

本文系统拆解EM-seq、TAPS两种商业化酶法转化技术涉及的全部核心酶、配套建库酶的功能与作用机制，横向对比BS-seq、EM-seq、TAPS三大甲基化转化技术的原理、优缺点与适用场景，并结合翌圣生物国产化酶原料与试剂盒解决方案，为科研人员、临床转化实验室提供选型与实验参考。

一、EM-seq酶法转化核心酶类及详细作用

EM-seq（NEBNext Enzymatic Methyl-seq）是全球最早商业化的酶法甲基化转化技术，采用先建库、后酶促转化流程，整套转化依赖TET2、T4-βGT（T4-BGT）、APOBEC3A三大核心酶协同完成甲基化区分，无强酸强碱，全程温和酶促反应。

1. TET2氧化酶

1）本质与催化条件：

α-酮戊二酸、Fe²⁺依赖型双加氧酶，翌圣通过ZymeEditor酶改造平台优化，氧化效率≥99%，批间稳定性优异。

2）核心作用机制：

对DNA中5mC逐级氧化，完成甲基化修饰胞嘧啶的保护：

5-甲基胞嘧啶（5mC）→5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）→5-甲酰胞嘧啶（5fC）→5-羧基胞嘧啶（5caC）

氧化生成的5caC空间结构发生改变，完全抵抗后续APOBEC3A脱氨作用，最终测序时仍识别为C；未被修饰的普通胞嘧啶无氧化修饰，会被脱氨转为U，PCR后读为T，实现甲基化位点区分。

3）配套反应要求：

反应体系需新鲜现配Fe(II)溶液启动氧化，缓冲液配套粉剂需提前离心至管底，重组缓冲液-20℃仅可保存4个月，氧化步骤可4℃过夜或-20℃冷冻暂停实验。

2.T4-β-葡萄糖基转移酶（T4-BGT）

1）核心功能：

特异性保护5hmC，TET2氧化产生的内源5hmC，可被T4-BGT催化糖基化，结合葡萄糖基团生成5gmC（5-葡萄糖基羟甲基胞嘧啶）；5gmC同样不受APOBEC3A脱氨，实现5mC、5hmC同时完整保留检测，解决传统BS-seq无法区分两种修饰的短板。

2）产品优势（翌圣自研原料）：

无核酸外切酶、切口酶残留，不会随机切割模板DNA，不破坏文库片段完整性，适配10–500 ng gDNA、cfDNA、FFPE多种降解样本。

3.APOBEC3A胞嘧啶脱氨酶（A3A）

EM-seq第二步转化核心酶，单链DNA特异性脱氨酶，锌离子依赖催化：

1）仅作用未修饰普通C：

单链DNA中无甲基化修饰的胞嘧啶（C）脱氨基转化为尿嘧啶U

2）完全不作用修饰胞嘧啶：

对TET2生成的5caC、T4-BGT生成的5gmC无催化活性

3） PCR扩增时

U与A配对，测序识别为T；甲基化修饰位点仍为C，最终数据格式与WGBS完全一致，可直接复用Bismark、bwa-meth等成熟分析流程，无需重构生信脚本。

操作注意点

DNA需经甲酰胺（推荐）或新鲜0.1 M NaOH变性为单链后，才能被A3A高效识别；脱氨后磁珠纯化不可过度干燥，否则DNA难洗脱、得率大幅下降。

4.EM-seq建库配套辅助酶（文库构建阶段）

除转化三步核心酶，完整EM-seq建库流程还需NGS常规分子酶，翌圣配套完整国产化试剂：

1）末端修复酶混合物：

包含T4 DNA Polymerase、T4 Polynucleotide Kinase、Taq DNA Polymerase，作用是补齐DNA打断后的粘性末端、3’端加A尾，保证接头稳定连接（翌圣货号12901ES、12902ES、13486ES）

2） T4 DNA连接酶：

连接EM-seq甲基化修饰专用接头，接头胞嘧啶预先甲基化保护，避免被A3A脱氨（翌圣货号12996等）

3） Q5U高保真尿嘧啶耐受DNA聚合酶：

耐受模板中大量U碱基，无扩增偏倚，完成文库PCR扩增（翌圣单酶货号10145ES，预混液货号12928ES）

4）可选：

甲基化专用片段化酶（Hieff UltraShear，12218ES），酶法打断不破坏甲基化修饰标记，替代超声Covaris打断。

图1. BS转化示意图（左）、EM-seq酶法转化示意图（中）与Taps转化示意图（右）

二、TAPS（eTAPS）酶法转化核心酶类及作用

TAPS（TET-assisted Pyridine Borane Sequencing）与EM-seq转化逻辑完全相反：甲基化5mC最终转为T，未甲基化C保持不变，文库碱基复杂度更高、测序数据利用率显著提升，可同步检测甲基化与基因组SNV、CNV变异，适合液体活检多组学联合分析。

1. TET1氧化酶（翌圣eTAPS专用TET1，12212ES试剂盒配套）

1）催化作用：

与EM-seq TET2功能相似，将5mC、5hmC全部氧化为5caC，但下游无T4-BGT糖基化步骤，直接进入还原反应

2）技术差异：

TET1氧化活性适配吡啶硼烷还原体系，反应条件更温和，室温即可完成氧化，更适配自动化96孔高通量建库平台。

2. 无APOBEC脱氨酶，核心化学还原剂：吡啶硼烷

TAPS体系不依赖胞嘧啶脱氨酶，是与EM-seq最关键区别：

1) TET1氧化生成的5caC，经吡啶硼烷还原为DHU（二氢尿嘧啶）；

2) 普通DNA聚合酶无法识别DHU，需配套专用兼容扩增酶；3）PCR第一轮延伸将DHU替换为T，最终测序中甲基化位点读T，未甲基化C保持C，碱基平衡、无严重AT/CG偏倚，测序Q30更高，比对速度提升3–5倍。

3. TAPS专属PCR扩增酶

普通高保真酶难以延伸含DHU模板，翌圣eTAPS试剂盒搭配双酶体系：

1. DHU特异性延伸酶：第一轮长延伸（30 min），将DHU高效转换为T；

2. 常规高保真U耐受聚合酶：后续指数扩增，降低PCR扩增偏倚，适配低拷贝cfDNA微量文库（翌圣单酶货号10145ES，预混液货号12928ES）。

补充：DM-seq对比（拓展酶法体系）

行业另一小众酶法DM-seq使用CxMTase羧甲基转移酶，先对未甲基化C、5hmC进行修饰保护，再用APOBEC3A仅脱氨5mC；该技术应用范围窄，仅用于特定位点甲基化精细验证，暂未大规模商业化。

三、BS-seq、EM-seq、TAPS三大甲基化转化技术全维度对比

1.核心转化原理与酶体系差异

技术	核心转化逻辑	关键酶 / 试剂	碱基转换规则
BSseq 重亚硫酸盐	强酸强碱化学脱氨，无酶参与	亚硫酸氢钠（化学试剂）	未甲基 C→T；5mC/5hmC 保留 C，无法区分 5mC 与 5hmC
EMseq 酶转化	酶促保护修饰 C，脱氨未修饰 C	TET2+T4BGT+APOBEC3A	未甲基 C→T；5mC/5hmC 均保留 C，可区分两种修饰
TAPS (eTAPS) 酶转化	酶氧化修饰 C，化学还原转化为 DHU	TET1 + 吡啶硼烷 + DHU 兼容 PCR 酶	5mC/5hmC→T；未甲基 C 保留 C，同步检测甲基化 + SNV

2.优缺点详细对比

1）BS-seq（传统金标准）

✅优势：试剂盒成本最低、技术成熟、数据库与生信流程完善、DNA输入范围极宽（0.1–2000 ng）；

❌缺陷：剧烈酸碱高温导致DNA降解90%以上，cfDNA、FFPE建库失败率高；高GC区域严重覆盖缺失；无法区分5mC/5hmC；文库碱基失衡，测序数据浪费严重；

适用场景：细胞系、新鲜组织等足量高质量完整DNA，预算有限、仅基础全基因组甲基化图谱研究。

2） EM-seq（主流临床酶法）

✅优势：全程温和酶促，DNA片段完整度高、文库插入片段更长；GC覆盖均匀，CpG岛捕获率提升；微量样本（10 ng起）稳定建库；可同时定量5mC与5hmC；数据兼容WGBS分析软件，学习成本低；重复性高；

❌缺陷：试剂成本约为BS-seq 4倍；转化总时长6–8 h，操作步骤多、2轮磁珠纯化；仍存在C→T碱基失衡问题；

适用场景：cfDNA液体活检、FFPE肿瘤组织、微量穿刺样本、胚胎微量细胞、需要同时检测5hmC的发育表观研究，是临床转化首选酶法。

3） TAPS（新一代低偏倚酶法）

✅优势：仅甲基化位点发生碱基转换，文库碱基复杂度高，测序效率大幅提升；可同步分析甲基化与基因组突变、拷贝数变异；DNA损伤程度最低，兼容单分子长读长三代测序；无APOBEC脱氨步骤，减少操作纯化；

❌缺陷：商业化时间短，生信流程普及度低于BS/EM-seq；配套专用扩增酶成本高；无法直接复用传统BS分析流程；

适用场景：肿瘤早筛多组学联合分析、单细胞甲基化、超高深度甲基化测序、需要同步挖掘突变与甲基化标记的临床队列研究。

3.关键实验指标对比

指标	BS-seq	EM-seq	TAPS(eTAPS)
最低 DNA 起始量	0.1 ng	10 ng	10 ng
DNA 损伤程度	极高（大量断裂丢失）	低（酶促温和）	极低
转化总时长	0.5–2.5 h	6–8 h	4–6 h
是否区分 5mC/5hmC	否	是	是
GC 覆盖偏倚	严重	轻微	几乎无
能否同步检测 SNV	否	否	是
数据分析兼容性	全流程成熟	兼容 BS 所有软件	需专用比对流程
单反应成本	低	高	较高

四、相关产品推荐

应用	货号	名称
片段化酶	12218ES	Hieff® MethyShear 甲基化片段化酶
甲基化转化试剂	12229ES	Hieff® Mag Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit 超快速DNA亚硫酸氢盐转化试剂盒（磁珠法）
	12213ES	DNA Enzymatic methyl-Conversion Kit DNA酶法甲基化转化试剂盒
	12212ES	Recombinant Ten-Eleven Translocase2.0 (eTET2.0, with buffer)
甲基化单链建库试剂盒	12221ES	Hieff NGS® Methyl-seq ssDNA Library Prep Kit for Illumina® V2 单链甲基化建库试剂盒
甲基化单链建库试剂盒	12226ES	Hieff NGS® Methyl-seq ssDNA Library Prep Kit for MGI® 单链DNA甲基化建库试剂盒
双链建库试剂盒	12214ES	Hieff NGS® dsDNA Methyl Library Prep Kit for Illumina® 双链甲基化建库试剂盒（WGBS、RRBS适用）
相关单酶产品	12928ES	Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase mix/ 耐U扩增酶（甲基化适用扩增酶）
	10145ES	Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA Polymerase (1 U/μL)
	14557ES	Recombinant Ten-Eleven Translocase 2.0 TET甲基胞嘧啶双加氧酶2.0 (TET 2.0)
	14553ES	Recombinant APOBEC3A (A3A) Protein
	14555ES	CpG-Specific Carboxymethyltransferase (CxMTase, 30 μM)
	14551ES	T4 Phage β-glucosyltransferase (T4-BGT) T4 β-葡糖基转移酶 (10 U/μL)
	12901ES	T4 DNA Polymerase T4 DNA聚合酶 (5 U/μL)
	12902ES	T4 polynucleotide Kinase T4多聚核苷酸激酶 (10 U/μL)
	13486ES	Hieff NGS® S-Taq DNA Polymerase for dA-Tailing
	14955ES	E.coli DNA Ligase E.coli DNA连接酶 (60 U/µL)
	15063ES	FuniCut® HpaII
	15064ES	FuniCut® MspI
	15052ES	FuniCut® DpnI