三代测序在全长转录组研究中的应用

2026-11-09

全长转录组（Full-length transcriptome）

PART 01

1、

全长转录组简介传统

全长转录组（Full-length transcriptome）是基于PacBio和Nanopore等三代测序平台，无需打断RNA或cDNA，直接获得包含5’UTR、3’UTR、polyA尾的mRNA全长序列及完整结构信息的测序技术。与二代测序（RNA-seq）依赖短读长（通常100-300 bp）和复杂的生物信息学拼接来推断转录本结构不同，三代全长转录组利用超长读长（可达数十kb）直接读取单个RNA/ cDNA分子从5'到3'的完整序列，从而获得“原生”的转录本信息，无需计算组装即可准确解析转录本结构。

图1 转录本短读长与长读长测序之间的根本区别在于，短读长 RNA-seq（RNA测序）仅能捕获转录本的微小片段。因此，这类数据缺乏明确的异构体信息，从而导致推断出许多错误的异构体。而长读长全长 cDNA 数据能够端到端地完整捕获整个转录本，使得对异构体的判定变得明确无误。

2、

全长转录组研究内容与意义

全长转录组测序的分辨率达到了 “转录本异构体（isoform）” 级别，这与传统基因水平的研究有着本质区别。其主要应用和研究意义包括：

研究方向	具体内容与意义
精准鉴定可变剪接	准确识别同一基因由于外显子跳跃、内含子保留、可变起始/终止位点等产生的多种转录本。这对于理解发育、分化及疾病（尤其是癌症）的发生机制至关重要。
发现新基因与新转录本	能够发现尚未被注释的新基因、新转录本以及非编码RNA（如lncRNA），极大地补充和完善现有基因组注释，尤其适用于非模式生物。
解析融合基因	在癌症研究中，可以直接检测到由基因组结构变异产生的基因融合事件，明确其断点和形成的融合转录本结构，为临床诊断和靶向治疗提供依据。
等位基因特异性表达分析	利用长读长可以区分来自父本和母本的等位基因，研究其特异性表达模式和转录本异构体偏好，揭示基因组印记等表观遗传调控机制。
无参考基因组物种的转录组研究	对于没有参考基因组的物种，全长转录组测序可直接构建高质量的Unigene数据库，作为该物种的“转录组参考序列”，为后续功能研究奠定基础。

三代测序 VS 二代测序

PART 02

1、

全长转录组研究中三代与二代测序核心差异

对比项	二代测序（RNA-seq）	三代测序（全长转录组）
测序原理	边合成边测序（荧光信号捕获）	PacBio：单分子实时荧光测序；Nanopore：纳米孔电信号测序
读长	短（50-300 bp）	超长（可达数十kb，甚至Mb级）
是否需要打断	是（RNA需打断成短片段）	否（无需打断，直接测全长分子）
转录本结构获取方式	依赖生物信息学组装（如Trinity、StringTie）拼接全长	直接读取单个分子全长序列，无需组装
可变剪接解析能力	有限（短读长难以连接远距离剪接位点，易错拼）	精准（直接捕获完整剪接位点，准确识别复杂AS事件）
新转录本发现能力	较弱（依赖组装，易漏检低丰度或复杂结构转录本）	强（直接测序，可发现大量未注释新转录本/异构体）
融合基因检测	较难（依赖读段跨断点，易假阳性/假阴性）	精准（直接读取融合转录本全长，准确鉴定融合异构体）
定量准确性（转录本水平）	较低（组装偏差、多同源异构体干扰）	较高（直接计数全长分子，更准确反映转录本丰度）
RNA完整性要求	相对较低（短片段也可测）	高（需完整RNA以获得全长转录本，RIN≥7-8）
成本	低	中（逐渐下降，仍高于二代）
数据通量	高（单次可测数亿条读段）	较低（PacBio单次SMRT Cell约数百万条HiFi读段；Nanopore较高但仍低于二代）
适用场景	基因水平表达定量、已知转录本差异分析、大样本筛查	转录本结构解析、新异构体发现、融合基因鉴定、低丰度转录本检测、无/复杂基因组物种注释

2、

三代与二代测序的选择与互补策略

1）选择策略：

若研究目标是基因水平的表达定量、大样本（数百以上）筛查或已知转录本的差异分析，且预算有限，优先选二代RNA-seq；
若研究需解析转录本结构（如可变剪接、融合基因、新异构体）、无参考基因组物种注释、低丰度转录本检测或复杂基因家族分析，必须选择三代全长转录组；
单细胞转录本水平研究：目前三代单细胞全长转录组（如scIso-Seq）是前沿方向，适合解析细胞类型特异性异构体，但成本较高。

2）互补策略：

二者并非互斥，常结合使用以兼顾结构准确性和定量深度：
用三代全长转录组获得高质量的转录本结构参考集（如新异构体、可变剪接事件）；
用二代RNA-seq进行大样本、高深度的转录本/基因表达定量（借助三代获得的转录本注释作为参考）；
这种“三代结构+二代定量”的组合是目前性价比高且数据利用最优的方案，尤其适用于有参物种的转录组研究。

三代全长转录组主流研究方法

PART 03

1、

PacBio Iso-Seq（全长转录组测序）

核心原理

基于 PacBio SMRT 单分子实时测序技术，通过滚环测序（CCS）生成高精度 HiFi reads，直接捕获全长 cDNA 序列，无需组装即可获得完整转录本信息。

建库流程

高质量总 RNA 提取，富集 polyA+ mRNA
逆转录合成全长 cDNA（Oligo dT 引物 + 模板转换技术）
cDNA 扩增与片段筛选，去除短片段干扰
构建 SMRTbell 哑铃型文库

技术优势：HiFi reads 准确率≥99.9%，全长转录本回收率高，适合精准转录本结构解析。

图2 Iso-Seq的建库实验流程

2、

Nanopore Direct RNA sequencing（纳米孔直接 RNA 测序）

核心原理

无需逆转录与 PCR 扩增，直接对天然 RNA 分子测序，保留 RNA 碱基修饰信息，实时读取完整 RNA 序列。

建库流程

总 RNA 提取，富集 polyA+ mRNA
直接连接测序接头与马达蛋白
无需逆转录、PCR 扩增，直接上样测序
纳米孔平台实时测序，获取全长 RNA 序列与修饰信息

技术优势：无 PCR 偏差，保留 m6A 等 RNA 天然修饰，适合 RNA 修饰与全长转录本同步研究。

图3 Direct RNA seq建库流程

3、

Nanopore cDNA-PCR Sequencing（纳米孔 cDNA-PCR 测序）

核心原理

先将 RNA 逆转录为 cDNA，通过 PCR 扩增富集全长 cDNA，再构建纳米孔测序文库，兼顾全长获取与测序通量。

建库流程

l RNA 逆转录合成 cDNA（链转换技术，可引入 UMI
l PCR 扩增富集全长 cDNA，纯化去除引物二聚体
l 末端修复、加 A 尾，连接纳米孔测序接头
l 上机测序，单链DNA分子穿过纳米孔，通过监测离子电流变化进行碱基识别

技术优势：是目前ONT平台上通量最高、成本效益最佳的全长转录组方案；起始RNA需求量低；可轻松实现大规模多样本混合测序；但存在PCR偏好性。

图4 cDNA-PCR Seq建库流程

翌圣生物产品解决方案

PART 04

应用	货号	产品名称	备注
RNA提取相关	19221	MolPure® Flash Cell/Tissue Total RNA Kit 快速细胞/组织总 RNA 提取试剂盒
	18605	MolPure® Magnetic Tissue Total RNA Kit 磁珠法组织总RNA提取试剂盒（瓶装）
	10325	Recombinant DNase I (RNase-free) 重组DNase I (大肠杆菌表达)
检测相关试剂	12642	1× dsDNA HS Assay Kit 即用型dsDNA qubit定量试剂	核酸/质粒/文库定量
	12643	dsDNA BR Assay Kit/ BR 双链DNA定量检测试剂
	80575	核酸定量仪荧光计Qubit（96通道）
	12602	Hieff NGS® RNA Cleaner RNA纯化磁珠	RNA纯化磁珠
	12418	Hieff NGS® DNA Selection Beads V2 DNA 分选磁珠 V2	三代建库纯化磁珠
ONT文库制备	13317~13320	Hieff® Native Barcode Kit for ONT	ONT平台专用Barcode，连接法专用
	12937	Hieff® LongSeq cDNA Library Prep Kit for CycloneSEQ	三代RNA逆转录成全长cDNA
	13302	Hieff® DNA Endprep&dA-Tail Module for ONT 末端修复/A尾添加模块
	13304	Hieff® Adapter Ligation Module for ONT /马达蛋白连接酶
	12266	Hieff NGS® MagSP rRNA Removal Kit (Mammal) with purification beads/磁珠法哺乳动物通用核糖体去除试剂盒	全长lncRNA建库前rRNA去除
	12264	Hieff NGS® MagSP rRNA Removal Kit (Bacteria(G- and G+)) with purification beads/磁珠法细菌核糖体去除试剂盒
	12262	Hieff NGS® MagSP rRNA Removal Kit (Plant) with purification beads / 磁珠法植物通用核糖体去除试剂盒
PB平台文库制备	14604	Hifair® Ultra Reverse Transcriptase (200 U/μL)
	14675	UCF.ME® High Affinity RNase Inhibitor (40 U/μL) 低残留、猪源RNase抑制剂
	14535	Exonuclease I 核酸外切酶I (20 U/μL)
	14525	Exonuclease III 核酸外切酶III (100 U/μL)
	14538	T5 Exonuclease T5核酸外切酶 (10 U/µL)
	10154	2× Hieff Canace® Plus PCR Master Mix (With Dye) 高保真酶预混液
	14537	Uracil-Specific Excision Reagent 尿嘧啶特异性切除试剂(1 U/μL)
	14957	Hieff® Taq DNA ligase (40 U/µL)