组织损伤后的修复并不是单一的细胞增殖过程，而是由炎症反应、细胞死亡、血管重建、细胞外基质重塑以及组织特异性细胞再生等环节共同参与的动态过程。近年来，干细胞来源外泌体因能够介导细胞间信息传递，逐渐成为再生医学和组织修复研究中的重要方向。

其中，间充质干细胞来源细胞外囊泡是目前研究较为广泛的一类。已有研究表明，这类囊泡能够携带蛋白质、脂质、mRNA和miRNA等生物活性物质，并通过调节免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞及损伤组织实质细胞的状态，参与炎症调控、血管生成、细胞存活和基质重塑。

一、从“外泌体治疗效果”回到三个基础问题

在评价干细胞外泌体是否能够促进组织修复之前，实验设计通常需要依次回答三个问题：

· 分离得到的样品是否符合细胞外囊泡的基本特征？

· 处理后，损伤组织的炎症、凋亡、血管及基质状态是否发生改变？

· 观察到的变化是否与特定信号通路或囊泡内活性成分相关？

这三个问题分别对应外泌体鉴定、修复效应评价和作用机制验证。抗体检测贯穿其中，但单个蛋白表达变化通常不足以支撑完整结论，更适合与透射电镜、粒径分析、细胞功能实验、组织学染色及动物功能指标联合使用。

  

二、外泌体样品鉴定：不仅要检测阳性标志物

1. 膜相关标志物：CD9、CD63和CD81

CD9、CD63和CD81属于四跨膜蛋白家族，是细胞外囊泡研究中常用的膜相关标志物。它们适合用于Western Blot、流式细胞术或免疫捕获实验，辅助判断样品中是否含有膜性囊泡。

需要注意的是，这些蛋白并非所有细胞外囊泡都稳定表达，也不是某一种囊泡亚型的绝对特异标志。因此，不宜将“CD63阳性”等同于“样品全部为纯外泌体”。

例如：CD9 Rabbit mAb

 

2. 囊泡形成相关蛋白：TSG101、ALIX

TSG101和ALIX参与内体分选及囊泡形成过程，常作为细胞外囊泡腔内或胞质侧相关标志物。将CD9、CD63或CD81等膜蛋白与TSG101、ALIX等蛋白联合检测，比仅检测一个阳性指标更有利于构建完整的鉴定证据。

例如：TSG101 Rabbit mAb

 

 

 

3. 非囊泡成分或细胞器污染指标：Calnexin等

外泌体鉴定不仅需要证明目标蛋白“存在”，还需要评价样品中是否混入细胞碎片、内质网、线粒体或其他非囊泡成分。Calnexin是常用的内质网相关蛋白，可作为外泌体制备物中的阴性或污染评价指标之一。

比如Western Blot组合可以包括：

· 膜相关蛋白：CD9、CD63或CD81；

· 囊泡形成相关蛋白：TSG101或ALIX；

· 污染评价蛋白：Calnexin；

· 同时设置亲本细胞裂解液作为对照。

翌圣生物现有外泌体蛋白检测试剂盒，并提供CD9、CD63、CD81、TSG101、Hsp70及Calnexin等抗体，可用于建立上述多指标鉴定组合。

三、炎症调控：关注炎症强度，也要关注免疫细胞状态

损伤发生后，局部炎症有助于清除坏死细胞和启动修复，但持续或过度的炎症反应可能进一步加重组织损伤。MSC来源细胞外囊泡被报道可影响NF-κB等炎症信号，并调节巨噬细胞及其他免疫细胞的功能状态。

推荐关注的蛋白指标

炎症信号通路

· NF-κB p65；

· Phospho-NF-κB p65；

· IκBα及Phospho-IκBα。

NF-κB p65总蛋白变化有时并不明显，因此，在研究通路活化状态时，应优先关注p65磷酸化水平、IκBα磷酸化或降解，以及p65核转位情况。

  

促炎和抗炎因子

· TNF-α、IL-1β、IL-6；

· IL-10等。

细胞因子可以通过Western Blot、ELISA、免疫组织化学或多因子检测平台进行分析。对于分泌到培养上清或血清中的因子，ELISA通常比检测细胞裂解液更能反映其释放水平。

  

巨噬细胞相关指标

· iNOS、CD86等常用于评价促炎相关状态；

· Arg1、CD206等常用于评价修复相关状态。

需要注意的是，真实组织中的巨噬细胞状态具有连续性和异质性，“M1/M2”只能作为简化分析框架。因此，建议同时检测多个表型指标、细胞因子及组织定位，而不是依据单一的CD206或iNOS变化作出结论。

在这一研究环节中，可将翌圣NF-κB p65 Mouse mAb（30044ES）、Phospho-NF-κB p65（Ser536）Rabbit pAb（31013ES）等抗体用于通路检测。相应抗体已提供WB、IHC或IF等应用数据，但具体实验条件仍需根据样本种属和组织类型进行优化。

  

四、细胞凋亡：不能只检测一个Caspase蛋白

缺血、氧化应激、机械损伤和炎症刺激均可能诱导组织细胞凋亡。许多干细胞外泌体研究会从线粒体凋亡通路和Caspase级联反应两个层面评价组织保护作用。

1. BAX与BCL2

BAX具有促凋亡作用，BCL2具有抗凋亡作用。实验中通常同时检测二者，并分析BAX/BCL2相对变化。仅观察BCL2升高或BAX降低，通常不足以完整判断凋亡状态。

2. Caspase-3及Cleaved-Caspase-3

Caspase-3以前体形式存在，发生剪切后形成活化片段。因此，评价凋亡时，Cleaved-Caspase-3通常比总Caspase-3更能反映Caspase通路的执行状态。

3. PARP、细胞色素c及组织水平验证

PARP剪切、线粒体细胞色素c释放以及TUNEL染色均可作为补充证据。较完整的评价组合可以是：

BAX/BCL2变化 + Cleaved-Caspase-3或Cleaved-PARP + TUNEL染色或流式凋亡检测。

翌圣细胞凋亡抗体产品中包含BAX Mouse mAb（30015ES）、BCL2 Mouse mAb（30046ES）、Caspase-3 Rabbit mAb（30053ES）及Cleaved-Caspase-3 p17 Rabbit mAb（31025ES）等，可根据实验目的是检测总蛋白还是活化片段进行选择。

 

五、血管生成：区分促血管信号与新生血管数量

血管重建能够为损伤区域提供氧气、营养物质和细胞迁移通道，是皮肤创伤、心肌缺血、骨修复及神经损伤等研究中的重要评价环节。干细胞来源细胞外囊泡在多种动物模型中表现出促进内皮细胞迁移、血管生成及组织再灌注的潜力。

VEGFA：促血管信号指标

CD31：血管内皮相关指标

翌圣可提供VEGFA Rabbit mAb（773031ES）及CD31 Mouse mAb（30038ES）。其中，VEGFA抗体可用于Western Blot，CD31抗体可用于组织血管相关检测；二者分别反映促血管信号和内皮细胞相关变化，实验中不建议相互替代。

  

六、纤维化与细胞外基质重塑：重点不只是“胶原是否下降”

组织修复后期需要重新沉积和排列细胞外基质。基质形成不足可能导致组织结构不稳定，持续过度沉积则可能发展为瘢痕或纤维化。因此，胶原蛋白的变化需要结合损伤时期和组织类型进行解释。

TGF-β/Smad信号

TGF-β1、Phospho-Smad2和Phospho-Smad3是纤维化研究中的常见指标。检测磷酸化Smad蛋白时，建议同步检测相应总蛋白，以区分通路活化变化与蛋白总量变化。

肌成纤维细胞及基质指标

常用指标包括：

· α-SMA：反映肌成纤维细胞活化；

· Collagen I和Collagen III：反映胶原沉积及组成；

· Fibronectin：反映细胞外基质形成；

· MMP2、MMP9及TIMP家族：反映基质降解与重塑平衡。

MSC-EVs在多种纤维化及损伤模型中被报道可调节TGF-β相关信号、成纤维细胞状态和胶原沉积，但不同组织、干细胞来源及处理条件可能产生不同结果。

针对基质重塑研究，翌圣现有Collagen I alpha Rabbit mAb（30061ES）、Collagen III alpha Rabbit mAb（30062ES）、Fibronectin Mouse mAb（30063ES）及Phospho-Smad2/3相关抗体，可用于构建从信号通路到基质沉积的检测组合。

七、组织修复标志物需要根据损伤类型选择

炎症、凋亡、血管生成和纤维化属于多种组织损伤共有的研究维度，但不能替代组织特异性功能评价。

· 软骨修复可关注SOX9、Collagen II、Aggrecan和MMP13；

· 神经损伤可关注NeuN、MAP2、GFAP及髓鞘相关蛋白；

· 心肌损伤可关注cTnT、α-actinin及心肌纤维化指标；

· 肾损伤可结合KIM-1、NGAL及肾小管结构评价；

· 皮肤创伤可关注角质形成细胞增殖、再上皮化、血管密度及胶原排列。

已有研究显示，MSC-EVs可在软骨损伤模型中影响SOX9、Collagen II、Aggrecan、MMP13及炎症相关通路，但这类指标不宜直接套用于心肌、肝脏或神经损伤研究。

结语

干细胞外泌体修复损伤组织的研究重点，正在从“是否有效”逐渐转向“哪类囊泡有效、通过什么靶细胞和通路发挥作用，以及如何建立可重复的质量评价标准”。

抗体检测在这一过程中承担着样品鉴定、作用机制分析和组织修复评价等多重任务。较为可靠的研究结论通常不是来自某一个条带的升高或降低，而是来自多维度蛋白指标、细胞功能实验、组织学结果及动物功能指标之间的一致性。

在抗体选择时，还应确认物种反应性、样本类型和适用实验。用于Western Blot的抗体不一定适用于石蜡组织IHC；适用于总蛋白检测的抗体也不能替代磷酸化或剪切位点特异性抗体。

 

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参考资料

1. Welsh JA, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023). Journal of Extracellular Vesicles, 2024. 2. Kou M, et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles for immunomodulation and regeneration. Cell Death & Disease, 2022.

3. Jung H, et al. Roles of extracellular vesicles from mesenchymal stem cells in tissue repair and regeneration, 2024.

4. Wei Q, et al. Small extracellular vesicles from mesenchymal stem cells in wound healing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2023.