类器官构建指南丨膀胱癌类器官篇
类器官构建指南丨膀胱癌类器官篇
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2026-09-24
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，据国家癌症中心数据，我国膀胱癌年新发病例约8.2万~9.1万例，年死亡约3.2万~4.3万例，发病率位居男性泌尿生殖系统恶性肿瘤第2位。
尿路上皮癌占膀胱癌的90%以上。约75%的患者初诊为非肌层浸润性膀胱癌，术后复发率高达50%~70%，部分进展为肌层浸润性膀胱癌后预后显著恶化。
膀胱癌具有高度的患者间和患者内异质性，限制了标准化治疗的疗效。
图1. 2020年全球膀胱癌发病率
传统2D培养和动物模型难以准确反映患者个体化的肿瘤异质性和药物反应。类器官技术可再现原发肿瘤的组织学特征、基因突变谱及药敏表型。
研究显示，采用优化培养方案后，膀胱癌类器官的建立成功率可达80%以上。
在药敏预测方面，类器官模型已证实可有效预测患者对顺铂、吉西他滨等标准治疗方案及靶向药物的临床应答，为个体化治疗提供了可靠的体外模型。
图2. 患者来源膀胱癌类器官的建立、表征及应用
膀胱癌类器官的构建主要包括样本采集与处理、组织解离与细胞分离、三维培养与类器官形成、传代与冻存四个环节。
1.组织离体后迅速转移至预冷组织保存液中，2-8℃低温转运至实验室，确保细胞活性。
2.Ceturegel®基质胶（40192ES）置于4℃冰箱过夜或冰上缓慢解冻；Cebrary®膀胱癌类器官培养基（41440ES）提前取出恢复至室温备用。
3.在生物安全柜中，将组织转移至含20mL预冷DPBS的离心管中，浸泡10分钟，弃上清，重复2-3次。
4.将组织转移至无菌培养皿，去除表面杂质、坏死组织及脂肪，用无菌剪刀或手术刀剪碎至直径约0.5-1mm³碎块。膀胱癌组织富含间质成分，建议尽可能去除纤维化区域。
5.将剪碎组织转移至新的50mL离心管，加入20mL预冷DPBS清洗1分钟，弃上清，重复2-3次。
6.加入10mL预热的组织消化液（41423ES），37℃摇床或培养箱中消化30-60分钟。期间每10分钟镜检观察，待组织块明显分散、悬液变浑浊时终止消化。
7.加入20mL DPBS（约2倍体积）终止消化，用移液器反复吹打至无明显大块残留。
8.100μm细胞筛网过滤去除未消化组织，收集滤液。向原消化管中加DPBS再次吹打并过滤，合并滤液，定容至40mL。
9.在4℃，300×g条件下离心5分钟，弃上清。
10.红细胞裂解（可选）：若沉淀中红细胞较多，加入2-5mL红细胞裂解液，室温静置1-2分钟，加DPBS终止裂解，再次离心。
11.用5mL DPBS重悬沉淀，离心洗涤1次，去除残留酶及裂解液。加入1mL DPBS重悬，计数并评估活率。
12.根据计数结果，使用DPBS将细胞悬液体积调整至5mL，再次离心获得浓缩细胞沉淀。
13.用预冷枪头，将预冷Ceturegel®基质胶与细胞沉淀按1:1体积比轻柔混匀（基质胶终浓度≥70%），调整至每μL基质胶含100-1000个细胞。全程冰上操作，避免气泡。
14.立即用预冷枪头吸取50μL细胞-基质胶混合液，滴加于24孔板孔底中央，确保液滴圆整、不与孔壁接触。
15.将培养板转移至37℃、5% CO₂培养箱，静置孵育15-30分钟至基质胶完全凝固。沿孔壁缓慢加入500μL预热的Cebrary®膀胱癌类器官完全培养基，避免冲散胶滴。
16.置于37℃培养箱中继续培养，每2-3天换液，每日镜检观察类器官形成、形态与生长状态。膀胱癌类器官一般7-14天可见类器官形成。
图3. 膀胱癌类器官培养情况
传代：当类器官生长密集、培养基变黄或胶滴出现中心坏死时进行传代。吸去培养基，用PBS洗涤，加入消化液37℃消化5-15分钟，轻柔吹打后加入终止液，300×g离心5分钟，按1:2~1:4比例重新包埋于新鲜基质胶中。
冻存：将消化后的类器官悬液离心，弃上清后加入适量类器官冻存液（41422ES）重悬，调整密度至200–500个/mL，分装至冻存管（1mL/管）。将冻存管置于程序降温盒中，以-1℃/min速率降温至-80℃，24h后转移至液氮中长期保存。
复苏：从液氮中取出冻存管，立即放入37℃水浴快速晃动1–2min至大部分融化。将悬液转移至含5mL预温培养基的离心管中，轻轻混匀，离心后弃上清，再用5mL培养基重悬洗涤一次。最后以适量培养基重悬，与基质胶混合后接种至培养板，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。
注： 操作全程需于生物安全柜或超净工作台内进行。所有与组织及细胞接触的离心管、吸头、筛网等耗材，使用前均需使用专用润洗液进行润洗，以最大限度减少细胞损失与粘附。
[1] Dyrskjøt L, Hansel DE, Efstathiou JA, et al. Bladder cancer. Nat Rev Dis Primers. 2023;9(1):58. Published 2023 Oct 26. doi:10.1038/s41572-023-00468-9
[2] Hekmatirad, S., Gholizadeh, F., Montazeri, S. et al. Patient-derived organoids as a predictive platform for drug sensitivity in bladder cancer. Sci Rep (2026). https://doi.org/10.1038/s41598-026-59564-x
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货号 |
产品名称 |
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Cebrary® Bladder Cancer Organoid Growth Medium (Human) 膀胱癌类器官生长培养基 |
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Ceturegel® Matrix for Organoid culture，Phenol Red-Free，LDEV-Free Plus 基质胶 |
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Cebrary® Cell recovery solution for Organoid 类器官回收液 |
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Cebrary® Cell freezing medium for Organoid 类器官冻存液 |
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Cebrary®Tissue Digestion Solution 组织消化液 |
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Cebrary® Tissue Storage Solution 组织保存液 |
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Cebrary® Organoid Rinsing Solution 类器官专用润洗液 |
