适用细胞模型

人 ES 细胞系（H1、H9）、人 iPS 细胞系：用于肝前体细胞定向诱导与扩增293T 细胞：用于基因编辑载体构建与病毒包装

图1 人多能干细胞向肝细胞样细胞分化的三步法小分子诱导方案。a 分化全流程时序示意图，分为定型内胚层诱导（Stage I）、肝前体细胞诱导（Stage II）、肝细胞成熟（Stage III）三个阶段，全程 13 天；b 各阶段核心小分子组合与细胞命运转变示意图；c 分化全过程细胞形态时序性变化明场成像图。

实验步骤

1) 人多能干细胞培养：采用无饲养层培养体系，将 hPSCs 接种于 Matrigel 包被的培养板，使用 mTeSR1 培养基维持多能性，待细胞融合度达 70%-80% 时传代。

2) 定型内胚层（DE）定向诱导：更换含 3 μM CHIR99021（Cat# 53003ES）+ 100 ng/mL Activin A（Cat# 95873ES）的 RPMI1640 培养基（含 B27（Cat# 60711ES） 补充剂），诱导培养 48 h，完成定型内胚层定向诱导。

3) 肝前体细胞诱导：DE 阶段结束后，更换含 1% DMSO（Cat# 60313ES）的 Knockout DMEM 培养基（含 Knockout 血清替代物），继续培养 5 天，获得高纯度肝干细胞 / 肝细胞前体，每 2-3 天更换新鲜培养基。

4) 肝细胞样细胞（HLCs）成熟培养：更换肝细胞培养基，添加 20 ng/mL HGF（Cat# 92055ES）+ 20 ng/mL Oncostatin M（Cat# 96088ES）+ 100 nM 地塞米松（Cat# 40323ES），继续培养 5-7 天，获得成熟功能型肝细胞样细胞。

图2 小分子组合高效诱导定型内胚层向肝前体细胞定向分化。a 生长因子诱导组（GF）与小分子诱导组（SM）肝前体细胞阶段细胞明场形态对比；b qPCR 检测两组肝谱系标志物（AFP、ALB、HNF4α）与胆管谱系标志物（CK18、CK19）的 mRNA 相对表达量；c ELISA 检测两组肝前体细胞的 AFP 分泌水平；d 两组细胞肝前体核心标志物 HNF4α（绿色）、AFP（红色）免疫荧光染色结果；e 两组 HNF4α⁺AFP⁺双阳性肝前体细胞比例统计。

实验结果

• 诱导第 2 天，细胞高表达定型内胚层特异性标志物 SOX17、FOXA2、CXCR4，双阳性率≥90%；
• 诱导第 7 天，细胞高表达肝前体细胞特异性标志物 AFP、HNF4α、CK18，阳性率≥85%，肝谱系特化符合预期；
• 诱导获得的肝前体细胞可稳定扩增 2 代以上，仍维持干性标志物表达与全谱系分化潜能；
• 成熟培养阶段结束后，细胞高表达肝细胞成熟标志物 ALB、A1AT、CYP3A4，具备白蛋白分泌、糖原储存与药物代谢核心功能。

图3 CHIR99021 激活 Wnt 信号对定型内胚层诱导效率的调控验证。a 不同 CHIR99021 处理条件下细胞形态明场成像对比；b 不同处理组内胚层核心标志物 SOX17、FOXA2 的 mRNA 表达水平定量分析；c 不同处理组 SOX17/FOXA2 双阳性细胞比例流式定量结果。

实验步骤

1) 细胞处理：诱导获得的肝前体细胞分别用 DMSO（Cat# 60313ES）（n=3）或诱导小分子组合处理，分别收集诱导 0 天、2 天、7 天、14 天的细胞样本。

2) 蛋白提取：使用 NP-40 裂解液（Cat# 20121ES）裂解细胞，提取总蛋白，冰上孵育 30 分钟，14,000 rpm 离心 10 分钟收集上清。

3) 蛋白定量：使用 BCA（Cat#20201ES）法测定蛋白浓度。

4) 还原烷基化：用 DTT（Cat# 20311ES）和碘乙酰胺（Cat# 52598ES）处理蛋白样本。

5) 酶切消化：用 Lys-C 和胰蛋白酶（Cat# 40512ES）对蛋白进行分步酶切消化。

6) TMT 标记：使用 TMTPro16 标记试剂标记肽段，每个样品用不同 TMT 标签标记。

7) 肽段分级：高 pH 反相肽段分级分离，设置 15 个梯度（7.5-55% 乙腈）。

8) 质谱分析：在 Orbitrap 质谱仪上进行 DDA-SPS-MS3 分析。

9) 数据分析：使用 Proteome Discoverer 软件进行蛋白质鉴定和定量。

实验结果

• 小分子诱导后，肝发育关键转录因子 HNF4α、AFP、HNF1α 等蛋白表达水平显著上调；
• Wnt、FGF、BMP 肝发育关键信号通路相关蛋白显著富集，证实小分子精准靶向调控目标通路；
• 诱导获得的肝细胞样细胞蛋白表达谱与人原代肝细胞高度匹配，白蛋白合成、药物代谢相关蛋白显著高表达。

实验步骤

1) 样本固定：肝前体细胞或肝细胞样细胞用 4% 多聚甲醛室温固定 30 分钟，PBS 洗涤 3 次。

2) 通透与封闭：0.3% Triton X-100 室温通透 15 分钟，5% BSA 室温封闭 1 小时。

3) 一抗孵育：加入对应一抗，4℃湿盒孵育过夜。

4) 肝前体细胞标志物：AFP、HNF4α、CK18

5) 成熟肝细胞标志物：ALB、A1AT、CYP3A4

6) 二抗孵育：PBS 洗涤 3 次后，加入荧光二抗，室温避光孵育 1 小时。

7) 核染：DAPI 室温避光孵育 10 分钟，PBS 洗涤 3 次。

8) 成像：使用激光共聚焦显微镜成像，观察标志物表达与空间定位。

图4 小分子诱导成熟肝细胞样细胞的标志物表达鉴定。a qPCR 检测未分化 hiPSC、生长因子诱导组（GF-iHep）、小分子诱导组（SM-iHep）、人原代肝细胞（hPH）的成熟肝细胞核心标志物 mRNA 相对表达量；b 两组细胞成熟标志物 ALB（绿色）、A1AT（红色）免疫荧光染色结果；c 两组细胞明场形态对比；d 两组 ALB⁺A1AT⁺双阳性成熟肝细胞比例统计。

实验结果

• 诱导获得的肝前体细胞高表达 AFP、HNF4α 双阳性标志物，阳性率≥85%；
• 成熟肝细胞样细胞高表达 ALB、A1AT，具备典型的肝细胞上皮样形态，与体内人肝脏组织细胞分布一致；
• 可检测到 CYP3A4 阳性成熟肝细胞，证实小分子诱导体系可实现肝谱系全谱系分化与功能成熟。

图5 小分子肝分化体系在人胚胎干细胞系 hESC-H1 中的通用性验证。a qPCR 检测分化第 3 天细胞多能性与定型内胚层标志物 mRNA 相对表达量；b 分化第 3 天细胞 FOXA2、SOX17 免疫荧光染色结果；c qPCR 检测分化第 8 天肝前体细胞标志物 mRNA 相对表达量；d 分化第 8 天细胞 AFP、HNF4α 免疫荧光染色结果；e qPCR 检测分化第 13 天成熟肝细胞标志物 mRNA 相对表达量；f 分化第 13 天细胞 ALB、A1AT 免疫荧光染色结果。

实验步骤

1) 细胞制备：诱导第 7 天的肝前体细胞用胰酶 - EDTA（Cat# 40127ES）消化为单细胞悬液，PBS 洗涤 2 次。

2) 固定与通透：使用流式固定破膜试剂盒处理细胞，室温固定 20 分钟，破膜 15 分钟。

3) 抗体孵育：加入 HNF4α-APC、AFP-PE 荧光抗体，室温避光孵育 30 分钟。

4) 上机检测：PBS 洗涤 2 次后，重悬细胞，使用 NovoCyte 流式细胞仪检测，分析 HNF4α/AFP 双阳性细胞比例。

5) 数据分析：使用 FlowJo 软件进行数据分析，以未诱导的 hPSCs 作为阴性对照。

实验结果

• 小分子诱导体系获得的肝前体细胞中，HNF4α/AFP 双阳性细胞比例≥85%，批次间差异≤10%；
• 优化的小分子组合可显著提升肝前体细胞诱导效率，显著优于传统无小分子诱导体系；
• 成熟培养后，ALB 阳性成熟肝细胞比例≥70%，分化效率稳定。

实验步骤

1) 样本收集：分别收集未诱导 hPSCs、诱导第 7 天肝前体细胞、诱导第 14 天肝细胞样细胞、人胎肝组织、成人原代肝细胞样本。

2) RNA 提取：使用 TRIzol 试剂提取总 RNA，Nanodrop 与琼脂糖电泳检测 RNA 纯度与完整性。

3) 文库构建与测序：构建 mRNA 测序文库，使用 Illumina 测序平台进行 PE150 测序。

4) 数据分析：比对人参考基因组，进行差异表达基因分析、GO/KEGG 通路富集分析、主成分分析（PCA），验证样本间转录组特征相关性。

图6 小分子诱导肝分化全过程全转录组特征分析，含未分化细胞、肝前体细胞、成熟肝细胞、人原代肝细胞的主成分分析（PCA）与肝发育基因时序表达热图；小分子诱导肝细胞样细胞的肝谱系特征基因富集分析，含肝发育、脂质代谢、药物代谢相关通路的 GO/KEGG 富集结果与功能基因聚类热图；小分子诱导肝细胞样细胞与人体各组织、不同发育阶段人肝组织的转录组特征匹配度评分与相似度分析

实验结果

• 小分子诱导的肝前体细胞，肝发育相关基因显著富集，与 hPSCs 相比差异表达基因主要集中在内胚层特化、肝发生相关通路；
• PCA 分析显示，肝细胞样细胞转录组特征与人原代肝细胞具有最高的相似度，与人胎肝组织匹配度次之，符合胚胎肝发育特征；
• 肝病模型细胞的差异表达基因，与临床肝病患者肝脏组织高度重合，证实模型的疾病模拟能力。

实验步骤（白蛋白分泌功能验证）

1) 样本收集：成熟肝细胞样细胞培养上清分别在培养 24 h、48 h、72 h 收集，-80℃冻存。

2) 检测：使用人白蛋白 ELISA 试剂盒检测上清中白蛋白浓度，根据标准曲线计算白蛋白分泌量，细胞计数后标准化为每 10⁶个细胞的白蛋白分泌量。

实验步骤（糖原储存功能验证）

1) 固定与染色：成熟肝细胞样细胞用 4% 多聚甲醛固定，PBS 洗涤后，使用过碘酸 - 希夫（PAS）染色试剂盒进行糖原染色，苏木素复染细胞核。

2) 成像：光学显微镜观察糖原染色情况，验证肝细胞糖原储存功能。

实验步骤（CYP450 药物代谢与肝毒性响应验证）

1) 分组：将成熟肝细胞样细胞分为对照组与给药组，给药组加入梯度浓度利福平（CYP3A4 诱导剂）、对乙酰氨基酚（肝毒性药物），对照组加入等量 DMSO（Cat# 60313ES），处理 72 小时。

2) 检测：qPCR 检测 CYP3A4 表达水平，CCK-8 检测细胞活力，TUNEL 染色检测肝细胞凋亡，验证药物代谢功能与肝毒性响应能力。

图7 小分子诱导肝细胞样细胞的全维度功能验证。a PAS 染色检测生长因子诱导组（GF-iHep）、小分子诱导组（SM-iHep）、人原代肝细胞（hPH）的糖原储存能力；b 奥美拉唑诱导后各组细胞 CYP1A2 酶活性定量检测；c Western blotting 检测各组细胞白蛋白蛋白表达水平；d ELISA 检测各组细胞白蛋白分泌水平；e 小分子诱导肝细胞样细胞的 ICG 摄取与释放实验结果。

实验结果

• 成熟肝细胞样细胞可稳定分泌白蛋白，分泌量可达 15-20 μg/10⁶ 细胞 / 天，具备成熟肝细胞的合成功能；
• PAS 染色显示细胞内存在大量糖原颗粒，证实诱导获得的肝细胞具备体内肝脏特有的糖原储存生理功能；
• 利福平可显著诱导 CYP3A4 表达上调，对乙酰氨基酚可剂量依赖性诱导肝细胞凋亡，证实该体系可用于药物代谢研究与肝毒性药物筛选。