适用细胞模型：人ES细胞系（H1、H9）、人iPS细胞系：用于肾前体细胞定向诱导与扩增；

293T 细胞：用于基因编辑载体构建与病毒包装；

实验步骤：

1) 人多能干细胞培养：采用无饲养层培养体系，将 hPSCs 接种于 Matrigel 包被的培养板，使用 mTeSR1 培养基维持多能性，待细胞融合度达 70%-80% 时传代。

2) 上胚层球状体制备：hPSCs 消化为单细胞悬液，低吸附 U 型板悬浮培养形成胚胎小体；更换含 100 ng/mL

Activin A（Cat# 95873ES） + 10 ng/mL BMP7（Cat# 92054ES）的 APEEL2 培养基，诱导 3 天形成极化上胚层球状体。

3) 中间中胚层定向诱导：更换含8-12 μM CHIR99021（Cat# 53003ES） + 200 ng/mL FGF9（Cat# 91337ES） +

1 μg/mL 肝素（Cat# 738416ES）的 APEEL2 培养基，根据目标谱系调整处理时长：2-3 天诱导输尿管芽祖细胞，

4-5 天诱导肾单位祖细胞。

4) 肾前体细胞扩增与干性维持：CHIR99021 处理结束后，更换含 200 ng/mL FGF9（Cat# 91337ES） + 1 μg/mL

肝素（Cat# 738416ES）的 APEEL2 培养基，继续培养 5-7 天，获得高纯度肾干细胞 / 肾前体细胞，每 2-3 天更换新鲜培养基。

5) 3D 肾脏类器官分化：将肾前体细胞消化为单细胞悬液，离心制备细胞团（每团 1.5×10⁶个细胞），

5 μM CHIR99021（Cat# 53003ES）脉冲处理 1 小时，转移至 Transwell 小室进行气液界面培养，培养基添加 200 ng/mL FGF9 + 50 ng/mL BMP7 + 0.1 μM 视黄酸，培养 18-20 天获得成熟肾脏类器官。

实验结果：

· 诱导第 7 天，细胞高表达肾前体细胞特异性标志物 SIX2、WT1、PAX2、LHX1，阳性率≥85%；

· 短时程 CHIR99021 处理组高表达输尿管芽祖细胞标志物 GATA3，长时程处理组高表达肾单位祖细胞标志物 HOXD11，谱系特化符合预期；

· 诱导获得的肾前体细胞可稳定扩增 3 代以上，仍维持干性标志物表达与全谱系分化潜能；

· 3D 培养可形成包含足细胞、近端小管、远端小管、集合管的完整肾脏结构，完美复现人类胚胎肾发生过程。

图1. CHIR99021处理时程精准调控中间中胚层前后轴谱系特化注：短时程（2-3 天）CHIR99021 处理定向诱导 GATA3⁺输尿管芽祖细胞（集合管谱系），长时程（4-5 天）处理高效诱导 HOXD11⁺肾单位祖细胞（肾单位谱系），实现两类核心肾前体细胞的可控分化。（来源于Takasato M et al., Nature, 2015, https://doi.org/10.1038/nature15695）

实验步骤：

1) 细胞处理：诱导获得的肾前体细胞分别用 DMSO（Cat# 60313ES）（n=3）或诱导小分子组合处理，分别收集诱导 0 天、3 天、7 天的细胞样本。

2) 蛋白提取：使用 NP-40 裂解液（Cat# 20121ES）裂解细胞，提取总蛋白，冰上孵育 30 分钟，14,000 rpm 离心 10 分钟收集上清。

3) 蛋白定量：使用 BCA 法测定蛋白浓度。

4) 还原烷基化：用 DTT（Cat# 20311ES）和碘乙酰胺（Cat# 52598ES）处理蛋白样本。

5) 酶切消化：用 Lys-C 和胰蛋白酶（Cat# 40512ES）对蛋白进行分步酶切消化。

6) TMT 标记：使用 TMTPro16 标记试剂标记肽段，每个样品用不同 TMT 标签标记。

7) 肽段分级：高 pH 反相肽段分级分离，设置 15 个梯度（7.5-55% 乙腈）。

8) 质谱分析：在 Orbitrap 质谱仪上进行 DDA-SPS-MS3 分析。

9) 数据分析：使用 Proteome Discoverer 软件进行蛋白质鉴定和定量。

实验结果：

· 小分子诱导后，肾发育关键转录因子 SIX2、WT1、PAX2、HOXD11 等蛋白表达水平显著上调；

· Wnt、FGF、BMP 肾发育关键信号通路相关蛋白显著富集，证实小分子精准靶向调控目标通路；

· 诱导获得的肾前体细胞蛋白表达谱与人胎儿肾脏原代肾祖细胞高度匹配。

实验步骤：

1) 样本固定：肾前体细胞或肾脏类器官用4%多聚甲醛室温固定30分钟，PBS洗涤3次。

2) 通透与封闭：0.3% Triton X-100室温通透15分钟，5% BSA室温封闭1小时。

3) 一抗孵育：加入对应一抗，4℃湿盒孵育过夜。

4) 肾前体细胞标志物：SIX2、WT1、PAX2

5) 输尿管芽祖细胞标志物：GATA3、PAX2

6) 肾单位分段标志物：足细胞（NPHS1、WT1）、近端小管（LTL、AQP1）、远端小管（CDH1）、集合管（AQP2）

7) 二抗孵育：PBS洗涤3次后，加入荧光二抗，室温避光孵育1小时。

8) 核染：DAPI室温避光孵育10分钟，PBS洗涤3次。

9) 成像：使用激光共聚焦显微镜成像，观察标志物表达与空间定位。

实验结果：

· 诱导获得的肾前体细胞高表达SIX2、WT1双阳性标志物，阳性率≥85%；

· 肾脏类器官中可观察到完整分段的肾单位结构，足细胞、近端小管、远端小管、集合管标志物分区明确，与体内人肾脏组织分布一致；

· 类器官中可检测到 FOXD1 阳性肾间质细胞与 CD31 阳性血管内皮细胞，证实全谱系分化潜能。

图2. 小分子诱导肾脏类器官的全谱系结构与成熟度鉴定注：免疫荧光染色验证类器官包含完整分段的肾单位（近端小管、远端小管、肾小球足细胞）、肾间质细胞与血管内皮细胞；透射电镜验证肾小管上皮顶端微绒毛、足细胞足突等成熟超微结构，证实小分子诱导体系可完整复现人肾发育的全谱系分化过程。(来源于Takasato M et al., Nature, 2015, https://doi.org/10.1038/nature15695)

图3. 基于上胚层球状体优化体系的肾小管类器官分化与谱系鉴定注：优化的小分子分步诱导方案，可驱动人多能干细胞经上胚层球状体定向分化为肾小管类器官，类器官高表达近端小管、足细胞、内皮细胞等肾谱系标志物，可整合至小鼠肾脏皮层实现体内定植。（来源于Freedman BS et al., Nat Commun, 2015, https://doi.org/10.1038/ncomms9715）

实验步骤：

1) 细胞制备：诱导第 7 天的肾前体细胞用胰酶 - EDTA（Cat# 40127ES）消化为单细胞悬液，PBS 洗涤 2 次。

2) 固定与通透：使用流式固定破膜试剂盒处理细胞，室温固定 20 分钟，破膜 15 分钟。

3) 抗体孵育：加入 SIX2-APC、WT1-PE 荧光抗体，室温避光孵育 30 分钟。

4) 上机检测：PBS 洗涤 2 次后，重悬细胞，使用 NovoCyte 流式细胞仪检测，分析 SIX2/WT1 双阳性细胞比例。

5) 数据分析：使用 FlowJo 软件进行数据分析，以未诱导的 hPSCs 作为阴性对照。

实验结果：

· 小分子诱导体系获得的肾前体细胞中，SIX2/WT1 双阳性细胞比例≥85%，批次间差异≤10%；

· 优化的小分子组合可显著提升肾前体细胞诱导效率，显著优于传统无小分子诱导体系。

实验步骤：

1) 样本收集：分别收集未诱导 hPSCs、诱导第 7 天肾前体细胞、诱导第 20 天肾脏类器官、人孕早期胎儿肾脏组织、成人肾脏组织样本。

2) RNA 提取：使用 TRIzol 试剂提取总 RNA，Nanodrop 与琼脂糖电泳检测 RNA 纯度与完整性。

3) 文库构建与测序：构建 mRNA 测序文库，使用 Illumina 测序平台进行 PE150 测序。

4) 数据分析：比对人参考基因组，进行差异表达基因分析、GO/KEGG 通路富集分析、主成分分析（PCA），验证样本间转录组特征相关性。

实验结果：

· 小分子诱导的肾前体细胞，肾发育相关基因显著富集，与 hPSCs 相比差异表达基因主要集中在中胚层特化、肾发生相关通路；

· PCA 分析显示，肾脏类器官转录组特征与人孕早期胎儿肾脏具有最高的相似度，与成人肾脏匹配度较低，符合胚胎肾发育特征；

· 多囊肾病模型类器官的差异表达基因，与临床多囊肾患者肾脏组织高度重合，证实模型的疾病模拟能力。

图4. 肾脏类器官与人类胎儿肾脏的转录组特征匹配性验证注：三维成像展示类器官内肾单位的空间分布与结构完整性；转录组测序分析证实，小分子诱导的肾脏类器官与人孕早期胎儿肾脏的基因表达特征高度匹配，完美复现人类胚胎肾发生的分子特征。（来源于Takasato M et al., Nature, 2015, https://doi.org/10.1038/nature15695）

实验步骤（葡聚糖内吞功能验证）：

1) 处理：将 10 kDa 荧光标记葡聚糖加入肾脏类器官培养基，终浓度 100 μg/mL，37℃孵育 24 小时。

2) 固定与染色：PBS 洗涤 3 次，4% 多聚甲醛固定，对近端小管标志物 LTL 进行免疫荧光染色，DAPI 核染。

3) 成像：共聚焦显微镜观察荧光葡聚糖的内吞情况，验证近端小管重吸收功能。

实验步骤（肾毒性药物响应验证）：

1) 分组：将成熟肾脏类器官分为对照组与给药组，给药组加入梯度浓度顺铂（0.1-100 μM），对照组加入等量  DMSO（Cat# 60313ES），处理 72 小时。

2) 检测：TUNEL 染色检测肾小管上皮细胞凋亡，qPCR 检测肾损伤标志物 Kim-1、NGAL 的表达水平。

实验结果：

· 近端小管上皮细胞可特异性内吞荧光葡聚糖，证实诱导获得的肾前体细胞分化的肾小管具备体内肾脏的重吸收生理功能；

· 顺铂可剂量依赖性诱导肾小管上皮细胞凋亡，肾损伤标志物表达显著上调，证实该体系可用于肾毒性药物筛选与安全性评价。

图5. 肾脏类器官近端小管生理功能与肾毒性响应能力验证注：荧光葡聚糖内吞实验证实，小分子诱导分化的近端小管具备体内肾脏特有的重吸收生理功能；顺铂剂量依赖性诱导肾小管上皮细胞凋亡，证实该体系可直接用于肾毒性药物筛选与安全性评价。（来源于Takasato M et al., Nature, 2015, https://doi.org/10.1038/nature15695）

实验步骤：

1) 靶点设计：针对多囊肾病致病基因 PKD1、PKD2，先天性肾病综合征致病基因 NPHS1 设计特异性 sgRNA，构建 sgRNA 表达载体。

2) 细胞转染：将 Cas9 表达载体与 sgRNA 载体共转染 hPSCs，嘌呤霉素（Cat# 727136ES）筛选阳性转染细胞。

3) 单克隆鉴定：有限稀释法获得单克隆细胞系，PCR 扩增靶点区域 Sanger 测序验证基因型，筛选无脱靶的纯合突变细胞系。

4) 分化诱导：使用上述小分子诱导体系，将突变型 hPSCs 定向诱导为肾前体细胞，进一步分化为肾脏类器官。

5) 表型鉴定：明场成像连续观察囊肿形成，免疫荧光染色验证病理表型，透射电镜观察超微结构改变。

实验结果：

· 成功获得 PKD1、PKD2、NPHS1 纯合突变的单克隆细胞系，经小分子诱导可正常分化为肾前体细胞；

· PKD1/2 突变型类器官在 3D 培养中自发形成大量充满液体的囊肿，囊肿起源于肾小管与集合管，与人类 ADPKD 病理特征完全一致；

· NPHS1 突变型类器官足细胞发育障碍，足突结构完全缺失，精准模拟先天性肾病综合征的病理改变，成功实现遗传性肾病的人源化建模。

图6. CRISPR 编辑突变型肾前体细胞构建常染色体显性多囊肾病（ADPKD）模型注：CRISPR-Cas9 靶向敲除多囊肾病致病基因 PKD1/PKD2 后，经小分子诱导分化的肾脏类器官可自发形成肾小管源性囊肿，精准复现人类 ADPKD 的核心病理表型，证实该体系可用于遗传性肾病的精准建模。（来源于Freedman BS et al., Nat Commun, 2015, https://doi.org/10.1038/ncomms9715）

实验步骤：

1) 细胞接种：将诱导第 7 天的肾前体细胞消化为单细胞，以 1×10⁵个 /cm² 的密度接种于 Matrigel 包被的培养板。

2) 扩增培养：使用含 200 ng/mLFGF9（Cat# 91337ES） + 1 μg/mL 肝素（Cat# 738416ES） + 5 μM  CHIR99021（Cat# 53003ES）的扩增培养基培养，每 2 天换液。

3) 传代培养：细胞融合度达 80% 时，按 1:3 比例传代，连续传代 3 次。

4) 干性验证：每代细胞通过免疫荧光、流式细胞术检测 SIX2、WT1 表达，通过分化实验验证全谱系分化潜能。

实验结果：

· 小分子扩增培养基可实现肾前体细胞的稳定扩增，7 天细胞扩增倍数≥10 倍；

· 连续传代 3 代后，细胞仍维持 SIX2/WT1 双阳性表达，阳性率≥80%；

· 扩增后的肾前体细胞仍可正常分化为完整分段的肾脏类器官，分化潜能无显著下降。