用Tunicamycin衣霉素诱导UPR和ER应激，验证MVA代谢通路和FPP积累的案例解析
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2026-05-26
文献标题：A metabolic alarmin from keratinocytes potentiates systemic humoral immunity
期刊：Nature (IF:48.5)
发表时间：2026.03.04线上发表
研究团队：清华大学刘万里教授团队、中国医学科学院皮肤病医院陆前进教授团队、中南大学湘雅二医院吴海竞教授团队
研究创新点：首次揭示一种关键的代谢中间物：FPP（法尼基焦磷酸）作为内源性“警报素”的功能以及在皮肤角质形成细胞内的甲羟戊酸（MVA）代谢通路，揭示了“皮肤信号→系统免疫”的全新分子通路，为系统性红斑狼疮（SLE）等自身免疫病的治疗，以及新型疫苗佐剂的研发提供了重要靶点和理论依据。
核心科学假说：皮肤感染或紫外线照射会激活角质形成细胞的未折叠蛋白反应（UPR）→ UPR驱动MVA代谢通路上调→ FPP在细胞质中大量积累→ FPP结合角质形成细胞内的TRPV3离子通道→ 钙离子内流→ 激活下游信号通路→ 产生IL-6和CCL20等细胞因子→ 增强引流淋巴结的生发中心反应和全身性IgG抗体应答。
一、实验背景：从“局部感染如何触发全身体液免疫”说起
局部感染为什么能够引发全身性的高效抗体应答？这是免疫学中一个长期悬而未决的核心谜题。
皮肤不仅是物理屏障，更是活跃的免疫哨所。传统上，科学家们已知感染或损伤会释放“损伤相关分子模式”（DAMPs），但究竟哪种分子、如何将局部的“警报信号”传递到远处的淋巴结，进而催生出持久的高亲和力抗体，此前一直不清楚。
近年来，“代谢相关分子模式”（MAMPs）概念的提出，暗示代谢中间产物可能扮演关键角色。在这项由清华大学刘万里教授团队、中国医学科学院皮肤病医院陆前进教授团队、中南大学湘雅二医院吴海竞教授团队等合作完成的研究中，作者聚焦于皮肤角质形成细胞内的甲羟戊酸（MVA）代谢通路，从中识别出了一种关键的代谢中间物----法尼基焦磷酸（FPP），并首次揭示其作为内源性“警报素”的功能。FPP作为内源性警报素，结合角质细胞内的TRPV3通道，诱导钙离子内流，进而激活下游信号通路促进IL-6和CCL20的产生，最终增强T滤泡辅助细胞和生发中心反应，提升抗原特异性IgG抗体水平。该研究首次揭示代谢中间体FPP通过TRPV3-IL-6/CCL20轴耦联局部皮肤事件与系统性体液免疫，为开发新型疫苗佐剂和治疗系统性红斑狼疮提供了潜在靶点。
二、实验方法：层层递进的验证链条
2.1 实验动物模型与关键材料
主要小鼠品系：
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- C57BL/6J：野生型对照组
- Trpv3-KO：全TRPV3基因敲除小鼠（由B. Xiao教授馈赠）
- Trpv3^(fl/fl)K5-cre：角质形成细胞特异性TRPV3条件敲除小鼠
- Il6^(fl/fl)K5-cre：角质形成细胞特异性IL-6敲除小鼠
- Ccr7-KO、Ccr6-KO：趋化因子受体敲除小鼠
- KikGR转基因小鼠：用于追踪树突状细胞迁移
- Fdps^(fl/fl)LysM-cre：髓系细胞特异性FPP合成酶敲除小鼠
- C57BL/6J：野生型对照组
感染菌株：
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- 铜绿假单胞菌（ATCC 27853）
- 金黄色葡萄球菌（Newman株）
- 化脓性链球菌（ATCC 19615）
- A族链球菌（GAS）
- 铜绿假单胞菌（ATCC 27853）
疫苗模型：
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- T细胞依赖性抗原：NP-KLH、OVA
- PCV13（13价肺炎球菌结合疫苗）
- T细胞依赖性抗原：NP-KLH、OVA
2.2 代谢物检测的核心技术
UPLC-MS/MS定量分析FPP：
采用Qtrap 6500+质谱仪联用超高效液相色谱（UHPLC），使用ACQUITY UPLC BEH C18柱进行分离。在负离子模式下监测381.2/78.8离子对（碰撞能量-53V）。
样品制备（组织）：
1. 取约20 mg感染皮肤组织（或指定数量的细胞）
2. 加入500 μL裂解液（50 mM NH4HCO3 pH 7.4，50%异丙醇），匀浆并超声处理
3. 加入1 mL甲醇，-20℃沉淀蛋白20 min
4. 14,000g离心10 min（4℃），上清液转移至玻璃管
5. 氮气吹干，50 μL乙腈:水（1:1）复溶，进样10 μL
用于培养基上清FPP检测时，需先经固相萃取（SPE）脱盐纯化：上样至Oasis HLB柱，2%甲酸洗涤，用NH₄OH/异丙醇/正己烷（1:7:12）洗脱后干燥复溶。
2.3 钙离子成像与电生理学验证
Ca²⁺流式检测：
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- 角质形成细胞加载Fluo-4 AM探针（终浓度1 μM，37℃孵育20 min）
- 加120 μM FPP刺激，BD Accuri C6流式细胞仪连续监测荧光强度变化
- 角质形成细胞加载Fluo-4 AM探针（终浓度1 μM，37℃孵育20 min）
全细胞膜片钳记录（HEKA EPC10放大器）：
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- 钳制电位0 mV，从-100 mV至+100 mV斜坡扫描（500 ms/周期，每5 s一次）
- 浴液：140 mM NaCl，5 mM KCl，2 mM CaCl₂，2 mM MgCl₂，10 mM HEPES（pH 7.4）
- 电极内液：140 mM CsCl，5 mM EGTA，10 mM HEPES，2 mM MgATP，0.2 mM NaGTP（pH 7.2）
- FPP终浓度1 μM，分别通过浴液（胞外）或电极内液（胞内）给药
- 钳制电位0 mV，从-100 mV至+100 mV斜坡扫描（500 ms/周期，每5 s一次）
2.4 分子对接与突变验证
研究者利用TRPV3晶体结构（PDB: 6UW6） 和PIP2结合TRPV5结构（PDB: 6DMU），通过Schrödinger套件的Protein Preparation Wizard识别FPP的潜在结合位点。
关键发现：FPP的焦磷酸头部与TRPV3细胞质结构域中的Arg416和Lys581形成氢键和盐桥，碳链长度与PIP2相似。
突变体功能验证：
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- 构建R416A、K581A、R416A/K581A突变体
- 在HEK293T细胞和TRPV3-KO A431细胞中过表达
- 仅WT TRPV3对FPP有钙流响应；突变体完全不响应（但对香芹酚/樟脑的反应正常，表明突变不影响通道基础功能）
- 构建R416A、K581A、R416A/K581A突变体
三、Tunicamycin衣霉素诱导UPR和ER应激相关实验详解
衣霉素（Tunicamycin）(Cat# 60251ES)在本研究中作为UPR（未折叠蛋白反应）的强效诱导剂，用于验证ER应激是否足以激活MVA代谢通路并导致FPP积累。论文Extended Data Fig. 6q中明确标注了Tunicamycin的使用条件：MOI=10 S. aureus感染组、LPS组、IMQ组、CpG组、IFN-I组、IFN-III组，以及Tunicamycin（衣霉素）2 μg/mL处理组和Thapsigargin（毒胡萝卜素）1 μM处理组。
Tunicamycin衣霉素在本研究中的工作浓度：
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实验参数 |
详细说明 |
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作用药物 |
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产品货号 |
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处理对象 |
小鼠原代角质形成细胞（分离自新生小鼠背部皮肤） |
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处理浓度 |
2 μg/mL |
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处理时间 |
12 h（与其他刺激组平行） |
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检测指标 |
MVA通路基因转录水平（Hmgcs1、Hmgcr）、FPP积累、IL-6/CCL20/TNF-α/TSLP表达 |
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实验目的 |
验证UPR激活是否足以驱动MVA代谢通路上调和FPP积累 |
产品使用提示：Tunicamycin（60251ES）属于细胞信号通路研究的重要工具试剂。使用Tunicamycin（60251ES）时建议进行浓度梯度预实验（推荐1–5 μg/mL），不同细胞类型对衣霉素的敏感性存在差异。
客户使用翌圣Yeasen产品（Tunicamycin衣霉素）发表的截图（图片来源于https://doi.org/10.1038/s41586-026-10167-6）
Tunicamycin作为经典ER应激诱导剂，通过抑制N-连接糖基化（阻断GlcNAc磷酸转移酶GPT），导致未折叠/错误折叠蛋白在内质网腔中积累，从而触发经典的PERK-eIF2α、IRE1α-XBP1和ATF6三条UPR信号通路。
在本研究中，研究者用Tunicamycin衣霉素处理原代角质形成细胞后，观察到与细菌感染相似的MVA通路激活和FPP积累。这一结果排除了病原体特异性信号（如TLR通路）是唯一驱动MVA通路上调的可能，证明了UPR本身足以启动这一代谢变化。更重要的是，Tunicamycin处理的FPP积累量介于中强度水平（Extended Data Fig. 5w），相对于感染条件的2–6倍增幅，Tunicamycin和Thapsigargin表现出不同强度的ER应激刺激，进一步支持了UPR通过PERK–eIF2α–SREBF轴激活MVA通路的分子机制。
FPP在离体小鼠原代角质形成细胞中，经紫外线照射（10 mJ/cm²）、TG处理（1 μM）、TU（链霉素）处理（2 μg/mL）及感染（感染复数（MOI）= 10）后，在指定时间点的细胞沉淀中的定量结果（图片来源于https://doi.org/10.1038/s41586-026-10167-6）
补充验证：eIF2α去磷酸化抑制剂
除了Tunicamycin，研究者还使用了Salubrinal（一种eIF2α去磷酸化抑制剂）来阻断UPR信号通路。在体外，Salubrinal处理显著抑制了MVA通路激活和FPP积累（Extended Data Fig. 6r）；在体内，Salubrinal处理小鼠后再感染GAS，病原特异性抗体应答显著受损（Extended Data Fig. 6s）。这双重验证（激活剂与抑制剂）构成了UPR→MVA→FPP这条信号轴的关键证据。
经Salubrinal处理后的相关指标的表达情况（图片来源于https://doi.org/10.1038/s41586-026-10167-6）
四、文章核心结论
本研究以严密的“实验事实→分子机制→疾病病理→转化意义”逻辑链条，揭示了如下核心结论：
1. FPP是一种全新的内源性“代谢警报素”。在皮肤细菌感染或紫外线照射后，角质形成细胞在数小时内通过UPR–PERK–eIF2α–INSIG1–SREBF轴上调MVA代谢通路，导致FPP大量积累。
2. FPP通过结合角质形成细胞TRPV3的胞内结构域发挥作用。关键结合位点为Arg416和Lys581（突变这两点即丧失功能），激活后引起Ca²⁺内流，进而启动CaM–calcineurin–NFAT和PYK2–RAS–ERK双信号通路。
3. 角质形成细胞是这一信号轴的执行细胞。产生的IL-6促进TFH细胞分化，CCL20招募CCR6⁺未成熟树突状细胞迁移至引流淋巴结并分化为成熟的cDC2，两者协同增强生发中心反应和抗原特异性IgG抗体应答。
4. FPP–TRPV3–IL-6/CCL20–GC轴的适度激活增强疫苗保护效力。FPP与HA蛋白或PCV13共免疫显著增强了对H1N1流感和肺炎链球菌的保护。
5. 该信号轴的过度激活参与系统性红斑狼疮（SLE）的发病与进展。SLE患者皮肤中TRPV3high角质形成细胞亚群MVA通路和APFs显著上调，且该轴活性与皮肤狼疮疾病面积和严重指数呈正相关。
五、实验用到的关键试剂整理汇总
该研究用到了大量高品质的细胞培养和分子生物学试剂，以下是根据文献整理的关键试剂及对应的Yeasen（翌圣生物）产品信息：
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产品名称 |
产品货号 |
产品应用简介 |
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Tunicamycin（衣霉素） |
一种从Streptomyces lysosuperficus中分离的核苷类抗生素混合物，通过抑制GlcNAc磷酸转移酶（GPT）阻断N-连接糖基化，是经典的ER应激和UPR诱导剂。在本研究中以2 μg/mL处理原代角质形成细胞12 h，用于验证UPR是否足以驱动MVA代谢通路上调和FPP积累。 |
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Thapsigargin（毒胡萝卜素） |
一种由内质网应激诱导的微粒体Ca2+-ATPase抑制剂，它能够有效地抑制不同细胞类型的病毒，如HCoV-229E、MERS-CoV和COVID-19的复制。在本研究中以1 μM处理小鼠原代角质形成细胞，用于验证UPR是否足以驱动MVA代谢通路上调和FPP积累。 |
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Salubrinal |
一种磷酸酶抑制剂，eIF2α去磷酸化的选择性抑制剂，阻断UPR信号通路。本研究以20 μM处理HaCaT细胞和2.0 mg/kg处理C57BL/6小鼠（静脉注射），用于验证细胞内 FPP 累积是感染期间产生有效抗体应答的必要前提。 |
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LPS, from E. coli O111:B4（脂多糖） |
脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，通过TLR4/MD2激活先天免疫信号通路。在本研究中作为TLR激动剂对照刺激原代角质形成细胞（Extended Data Fig. 6q），验证MVA通路的激活是否依赖于TLR信号通路。 |
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NP-40 Lysis Buffer（NP-40裂解液） |
一种较温和的细胞/组织裂解液，含多种磷酸酶和蛋白酶抑制剂，用于提取总蛋白或组分蛋白。在本研究中用于细胞裂解，配合Western blot检测SREBF核转位和信号通路蛋白磷酸化。 |
参考文献
[1] Ji, Z., Gao, J., Zhang, S. et al. A metabolic alarmin from keratinocytes potentiates systemic humoral immunity. Nature. 652, 209–219 (2026). https://doi.org/10.1038/s41586-026-10167-6.
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