从0到1，细胞转染实操全攻略（手把手教学版）
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2026-03-10
经历了基础理论的铺垫，走过了方法选择的纠结，今天，我们终于要亲手操刀了。
对于实验小白来说，第一次站在超净台前准备转染时，内心往往是慌张的：先加什么后加什么？混匀是用枪吹打还是涡旋？静置15分钟是看表还是计时？别怕。这篇手把手教学版将带你走一遍完整的细胞转染流程。我们将以实验室最常用的六孔板+脂质体法转染贴壁细胞为例，细化到每一个动作、每一个刻度。跟着做，你也能一次成功。
转染试剂操作示意图
第一部分：战前准备——把这些东西备齐再动手
！千万不要边做边找东西！在打开超净台之前，请按照清单核对物料：
细胞：状态健康的贴壁细胞（如HEK293T、Hela等），提前一天传代。
核酸：去内毒素抽提的高纯度质粒DNA，siRNA或者目的mRNA。
培养基：
耗材： 1.5mL或2mL无菌EP管（无RNA酶）、100μL/200μL/1000μL无菌枪头、六孔板。
标记笔： 在管壁上做好标记，防止混淆。
第二部分：Day 0——细胞铺板（这是成功的基石）
转染当天的细胞密度，直接决定实验结果。这一步通常在转染前一天的下午进行。
操作步骤：
(1) 消化计数， 取对数生长期的细胞，胰酶消化后，用完全培养基重悬，进行细胞计数。
(2) 计算密度， 目标是转染当天（Day 1）细胞融合度达到70%-90%。不同细胞生长速度不同，需要经验。
如：HEK293T（长得快）： 铺板密度 0.25-1×106 细胞/孔。
谨慎做法： 如果不确定，可以铺一个密度梯度（比如两个孔铺3×105，两个孔铺5×105），第二天选最合适的那一孔用。
(3) 铺板： 将稀释好的细胞悬液加入六孔板，每孔最终培养基总量为2mL。十字摇晃法混匀（切勿打圈，防止细胞聚集成堆），放入培养箱过夜。
第三部分：Day 1——转染实操
(1) 转染当天，观察细胞：密度合适，形态舒展，无污染。现在开始正式转染。
步骤1：稀释转染试剂（A液）
取一个无菌EP管，加入 150μL Opti-MEM（或无血清DMEM）。
加入 5μL Lipofectamine 2000（轻柔加入，不要触碰管壁损耗）。
操作要点： 轻轻弹匀或颠倒混匀，禁止涡旋。室温静置 5分钟。
步骤2：稀释DNA（B液）
取另一个无菌EP管，加入 150μL Opti-MEM。
加入 2.5 μg 质粒DNA（根据浓度换算体积，比如浓度1μg/μL就加2.5μL，具体比例可以根据实验情况调整一般DNA：转染试剂比例在1：2左右）。
操作要点： 轻轻吹打或弹匀。
步骤3：混合（A+B）
关键操作： 静置5分钟后，将A液（稀释的脂质体）逐滴加入B液（稀释的DNA） 中，或者将B液加入A液（通常推荐将脂质体加入DNA，但两者均可，保持一致性最重要）。混匀： 轻轻弹匀或颠倒混匀。静置： 室温孵育 15-20分钟。
注意： 时间不宜超过20分钟，否则复合物会聚集，降低效率。
步骤4：换液与转染
给细胞换液： 在复合物静置期间，从培养箱取出六孔板，吸掉旧培养基。每孔加入 1.75 mL 新鲜完全培养基（是否需要加抗生素？这里看情况，通常含双抗问题不大，但若细胞敏感，可换无双抗培养基）。
加入复合物： 孵育结束后，将EP管中的约300μL混合液，逐滴均匀地加入到六孔板中。
混匀： 加入后，再次十字摇晃六孔板，让复合物分布均匀。
放入培养箱： 37℃，5% CO2 继续培养。
第四部分：转染后处理——别急着收样
1. 换液（4-6小时后）
要不要换？ 看细胞。娇气细胞（如HUVEC、原代细胞）： 转染后4-6小时，建议吸掉含有转染复合物的旧培养基，换成新鲜的完全培养基，以降低毒性。皮实细胞（如293T）： 可以不换，持续培养至收样。
操作： 若换液，提前预热培养基，轻柔操作，避免冲掉贴壁不牢的细胞。
2. 观察与检测
看荧光： 如果转了GFP质粒，转染后6-8小时可能就有微弱荧光，24-48小时达到高峰。可以在荧光显微镜下初步估算转染效率。
3. 收样：
提RNA/QPCR： 转染后 24-48小时 收样（针对过表达）；转染siRNA敲低基因，通常在 48小时 收样效果最好（mRNA降解需要时间）。
提蛋白/Western Blot： 过表达在 48-72小时 收样；敲低在 72小时 收样（蛋白半衰期长的话需要更久）。
第五部分：避坑指南——手把手教你应对翻车现场
场景1：加了转染试剂，第二天细胞死了一大片。
原因： 脂质体毒性过大，或者细胞密度太低。
对策： 下次减少脂质体用量（比如从5μL降到3μL），或者增加细胞铺板密度。记得转染后4-6小时准时换液。
场景2：荧光很多，但细胞形态都变了，飘起来了。
原因： 虽然效率高，但细胞状态已受损，此时提的蛋白或RNA可能不代表真实的生理状态。
对策： 降低DNA用量（比如从2.5μg降到1.5μg），在效率和毒性之间找平衡点。
场景3：完全没有荧光。
原因排查：
质粒问题，确认质粒是否带有正确的荧光标签，启动子在细胞中是否工作？
污染问题， 质粒提取是否有内毒素或乙醇残留？
静置时间， 复合物静置时间够吗？是不是忘记静置直接加进去了？
培养基问题， 稀释复合物时是否误用了含血清的培养基？
场景4：只有周边有荧光，中间没有。
原因： 加入复合物后没有摇匀，或者摇匀方式不对。
对策： 下次加入复合物后，务必十字摇晃，不要打圈，也不要剧烈震荡。
结语
细胞转染，其实就是一场精细的手工活。从铺板的密度，到混合液的比例，再到换液的时间点，每一个细节都需要注意。
翌圣基础科研类转染试剂，专为满足基础科研领域多应用场景的核酸递送需求而设计。凭借成熟的技术体系，我们开发了涵盖质粒DNA、RNA及体内递送的多类型转染试剂。通过精准优化核酸兼容性与转染效率，这些试剂能够完美适配基因表达调控、功能验证等多样化的科研场景。其卓越的性能已在包括CNS等顶级期刊在内的实验数据中得到验证，为科研工作者提供可靠的工具支持。
转染试剂选择指南
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货号 |
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产品 名称 |
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细胞 类型 |
常规细胞 |
常规细胞 |
常规细胞 |
常规细胞 |
昆虫细胞 |
常规细胞 |
常规细胞 |
常规细胞 |
常规细胞 |
常规细胞 |
常规细胞 |
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难转染 |
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难转染 |
难转染 |
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原代 |
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原代 |
原代 |
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干细胞 |
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干细胞 |
干细胞 |
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核酸 类型 |
DNA |
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DNA |
DNA |
DNA |
DNA |
DNA |
DNA |
DNA |
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siRNA |
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siRNA |
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miRNA |
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ASO |
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mRNA |
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mRNA |
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应用 场景 |
用于各种核酸及原代等难转染细胞系 |
普遍用于多种细胞DNA转染 |
用于siRNA和miRNA转染，在多种难转染细胞上均能高表达 |
mRNA转染专用，在多种难转染细胞上均能高表达 |
针对sf9和High Five等昆虫细胞进行杆状病毒及质粒DNA转染 |
通用型病毒包装转染试剂（适用于LV及AAV） |
AAV病毒包装专用转染试剂 |
LV慢病毒包装专用转染试剂 |
CHO悬浮细胞瞬转表达蛋白、抗体，含转染试剂、培养基、补料 |
293悬浮细胞瞬转表达蛋白、抗体，含转染试剂、培养基、补料 |
用于抗体、蛋白、细胞因子等瞬转表达，满足CHO及293悬浮细胞系需求 |
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对标 竞品 |
thermo-lipo3000 |
thermo-lipo2000 |
thermo-RNAiMAX |
thermo-Messenger MAX |
thermo-Cellfectin |
polyplus-PEIpro GMP |
polyplus-FectorVIR-AAV GMP/ PEIpro |
polyplus-FectorVIR-LV/PEIpro |
thermo-ExpiCHO 瞬转 试剂盒 |
thermo-Expi293 瞬转 试剂盒 |
polyplus-FectorPRO |
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产品名称 |
产品规格 |
产品货号 |
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Hieff Trans® LipoBooster 3000 Transfection Reagent Lipo3000转染试剂 |
100μL/0.75 mL/1.5mL |
40801ES01/03/04 |
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100 μL/1 mL |
40802ES01/03 |
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100μL/0.75 mL/1.5mL |
40807ES01/03/04 |
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100μL/1mL |
40809ES01/03 |
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100μL/1mL |
40810ES01/03 |
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1 mL /10 mL /100 mL |
40818ES03/10 |
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1.5 mL /10 mL /100 mL |
40820ES04/10 |
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10 mL /100 mL/1L |
40821ES10/60 |
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1 mL /10 mL /100mL |
40823ES03/10 |
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10 mL /100 mL /1L |
40824ES10/80 |
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1 mL /10 mL /100mL |
40825ES03/10 |
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Hieff Trans® UltraProFect-CHO Transfection Reagent Kit CHO瞬转表达试剂盒 |
1000 mL |
40828ES80 |
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Hieff Trans® UltraProFect-HEK293 Transfection Reagent Kit HEK293瞬转表达试剂盒 |
1000 mL |
40829ES80 |
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1 mL /10 mL /100mL |
40830ES03/10 |
文末福利
扫码可免费领取转染试剂试用装
