实验所用转染试剂

试剂名称	货号
Hieff Trans®RNAiBoost Transfection Reagent转染试剂	40807ES

细胞培养与传代（T25）

润洗：吸弃旧培养基，加入3-4 mL常温PBS轻晃润洗10-20秒后吸弃。

消化：加入1 mL胰酶润湿瓶底，37°C孵育消化。

吹落：待细胞间隙变大、形态变圆时，直接用胰酶轻轻吹打下细胞。

终止：加入2-3 mL完全培养基终止消化，吹打混匀成细胞悬液。

接种：收集悬液，200 ×g离心3-5分钟，弃上清，用新鲜培养基重悬后分瓶，补足培养基继续培养。

将LLC细胞常规培养于含10g/dI胎牛血清的DMEM培养液中，置于37°C、5%CO2培养箱中恒温培养，待细胞融合率达85%时进行传代操作，为后续转染及感染实验备用。

细胞转染（6孔板）

一、 实验前准备（按说明书配液，一套操作10分钟搞定）

1. 细胞准备： 转染前24小时，用胰酶消化并重悬细胞后，进行细胞计数。以合适的密度（5E5/mL）将细胞接种于6孔板中，每孔加入2mL完全培养基。目标是转染时细胞的汇合度达到60% - 80%。本次实验细胞汇合度60%就开始转染。

2. 试剂准备：

o siRNA： 合成高质量siRNA，通常设计3个不同siRNA进行验证，初始浓度调整成20μM。

o 转染试剂： 将RNAiBoost试剂在4°C冰箱外静置回温，使用前轻轻吹打。

o 无血清培养基： 准备用于稀释siRNA和转染试剂的基础培养基（如Opti-MEM）。

二、 细胞转染

1. 稀释siRNA： 吸取5 μL siRNA溶液与25 μL Enhancer增强剂溶液充分吹打混匀；

2. 稀释转染试剂：吸取10 μL RNAiBoost体外转染试剂溶液与（1）中溶液混合，并充分吹打混匀，室温孵育5 min。

3. 细胞转染： 孵育结束后，向（2）中混合溶液加入60 μL的opti-MEM转染稀释液，并充分吹打混匀，随后将混合后的100μL转染复合物加入到6孔板的一个孔中，摇动混匀培养板中的液体，可根据需要的孔量进行配制转染复合物。

4. 细胞培养及检测：将细胞放回37°C、5% CO₂培养箱中培养；24 -48 h后检测细胞基因沉默水平。

 

三、 转染后处理

1. 换液： 转染后4-6小时，仔细观察细胞状态。若出现明显毒性，应吸弃含复合物的培养基，更换为2 mL新鲜预热的完全培养基。若细胞状态良好，可以不换液。本次实验不换液

2. 检测： 通常培养48小时后，提RNA进行检测。本次实验转染后48h进行qPCR检测。

小贴士：

1、如果转染后有显著的细胞毒性，可以在6h换液或将用量减半，可以避免细胞毒性问题；

2、如果转染效率比较低，可以通过提高转染试剂用量，能够有效提高转染效率；

3、稀释saRNA和转染试剂，最好使用opti-MEM；

4、转染试剂兼容血清和双抗，但是稀释质粒和转染试剂用的必须是无血清无双抗培养基。

5、需严格按照表格中推荐用量进行转染复合物制备，如若增加或减少用量，需要等比例减少，以6孔板为例，若按照终浓度50nM进行实验，则按照说明书配置100ul转染复合物即可，若需要用量翻倍，需要配置200ul转染复合物添加到孔板中；相反，若用量减半，按照表格推荐用量，配置好的100ul转染复合物，只需要添加50ul即可。

实验结果分析

在LLC小鼠肺癌细胞转染siRNA，用翌圣 RNAiBoost转染，并通过qPCR检测转染效率。

 

数据来源： 东南大学

使用翌圣 RNAiBoost转染试剂在LLC小鼠肺癌细胞转染siRNA，结果显示，翌圣RNAiBoost 转染试剂能够高效转染，敲低效率高达90%以上，显著降低目的基因表达。

    

不同培养皿RNAiBoost转染试剂用量使用指南

 

细胞培养板	细胞培养基体积	saRNA溶液 （原液浓度20 μM）	增强剂	转染试剂	无血清培养基体积	转染复合物体积
24孔板	500 μL	1.25 μL	6.25 μL	2.5 μL	15 μL	25 μL
12孔板	1.0 mL	2.5 μL	12.5 μL	5 μL	30 μL	50 μL
6孔板	2.0 mL	5 μL	25 μL	10 μL	60 μL	100 μL

 

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