干货 | 人肾脏类器官构建知多少？一文读懂！

肾脏类器官是利用人多能干细胞在体外三维培养形成的“微型肾脏”，其包含足细胞、肾小管等多种关键细胞与结构，能高度模拟真实肾脏，为疾病建模、药物筛选与毒性评估提供了革命性的人类体外模型。本文根据《Nature Protocols》发表的文章，整理了人类多能干细胞生成肾脏类器官的培养方案。

图1.hPSC分化为肾脏类器官的过程

PART.1

hPSCs的准备与铺板

细胞消化：取一瓶在6孔板中生长良好、汇合度约80%的hPSCs（培养于ReproFF2或类似培养基中）。吸弃孔内的原有培养基，加入500 µl Accutase（40506ES），于37°C孵育15分钟至细胞完全解离。
计数与重悬：使用含FGF2（91330ES）的培养基中和消化反应，收集细胞并计数。离心后弃上清，使用含10 ng/ml FGF2和10 µM Y27632（53006ES）的ReproFF2培养基重悬细胞。
铺板：将细胞密度调整至 44,000 - 86,000 cells/ml。向Ceturegel^®基质胶（40190ES）包被的24孔板的每个孔中加入 500 µl 细胞悬液进行铺板（即 22,000 - 43,000个细胞/孔，密度约为 12,000 - 24,000 cells/cm²）。

注：最佳密度因细胞系而异，例如H9细胞推荐约20,000 cells/cm²，HDF-α iPS细胞推荐约14,000 cells/cm²。
培养：将细胞置于37°C、5% CO₂培养箱中静置培养 72小时，期间无需换液，直至细胞汇合度达到约50%。

PART.2

肾单位祖细胞诱导

启动分化（Day 0）：吸弃培养基，用500 µl PBS轻柔清洗一次。随后加入 500 µl 含 3-10 µM CHIR99021（53003ES）的基础分化培养基（Advanced RPMI 1640 + L-GlutaMAX），根据细胞系类型，可选择性添加5-25 ng/ml Noggin（92528ES），以优化诱导效率。
首次换液（Day 2）：吸弃旧培养基，加入 500 µl 含相同浓度CHIR99021的新鲜基础分化培养基。
Activin A处理（Day 4）：培养4天后，于显微镜下观察，应出现“松散密集的细胞团簇”。吸弃旧培养基，加入 750 µl 含 10 ng/ml Activin A 的基础培养基，连续培养 3天。
FGF9处理（Day 7）：吸弃旧培养基，加入 500 µl 含 10 ng/ml FGF9 的基础培养基，连续培养 2天。至Day 9，可通过免疫荧光染色验证，通常可获得高比例的SIX2阳性肾单位祖细胞。

图2.hPSC分化过程中的形态变化

PART.3

3D肾脏类器官形成与成熟

消化与收集（Day 9）：吸弃孔板内的培养基，加入300 µl PBS清洗后吸弃。加入 300 µl Accutase，于37°C消化10-15分钟。用移液器轻柔吹打使细胞完全离散，并用等体积基础分化培养基中和。
3D接种：离心收集细胞，弃上清。使用含 3 µM CHIR99021 和 10 ng/ml FGF9 的基础分化培养基重悬细胞，将密度调整至 500,000 cells/ml。向96孔超低附着板的每个孔中加入 200 µl 细胞悬液（即 100,000个细胞/孔）。
离心聚集：将培养板以 300 × g 离心 15秒，使细胞在孔底中心聚集。
预聚合体形成（Day 9-11）：将培养板放入培养箱中，连续培养 2天。
肾小泡形成（Day 11-13）：使用200 µl移液器轻柔吸弃100 µl旧培养基，注意避免吸到细胞团。加入 200 µl 含 10 ng/ml FGF9（不含CHIR99021）的新鲜基础分化培养基。继续培养 2-3天，直至在显微镜下观察到清晰的、具有折光性的球状肾小泡结构。
成熟与维持（Day 14+）：轻柔吸弃 85-100 µl 旧培养基，加入 100 µl 不含任何生长因子的基础分化培养基。此后，每2-4天按此比例更换一次新鲜培养基。肾单位结构通常在1-2周内逐渐发育成熟。

图3.NPC和肾单位的免疫染色

PART.4

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