肠癌类器官的构建主要包括样本采集与处理、组织解离与细胞分离、三维培养与类器官形成、传代与冻存四个环节。

（一）样本准备与预处理

1.组织离体后迅速转移至预冷组织保存液中，2-8℃低温转运至实验室，确保细胞活性。

2.Ceturegel^®基质胶（40192ES）置于4℃冰箱过夜或冰上缓慢解冻；Cebrary^®肠癌类器官培养基（41484ES）提前取出恢复至室温备用。

（二）组织清洗与处理

3.在生物安全柜中，将组织转移至含20mL预冷DPBS的离心管中，浸泡10分钟，弃上清，重复2-3次。

4.将组织转移至无菌培养皿，去除表面杂质、坏死组织及脂肪，用无菌剪刀或手术刀剪碎至直径约0.5-1mm³碎块。

（三）组织消化与细胞分离

5.将剪碎组织转移至新的50mL离心管，加入20mL预冷DPBS清洗1分钟，弃上清，重复2-3次。

6.加入10mL预热的组织消化液（41423ES），37℃摇床或培养箱中消化20-40分钟。期间每10分钟镜检观察，待组织块明显分散、悬液变浑浊时终止消化。肠癌组织消化时间建议控制在30分钟以内，过度消化会损伤细胞活性。

7.加入20mL DPBS（约2倍体积）终止消化，用移液器反复吹打至无明显大块残留。

8.100μm细胞筛网过滤去除未消化组织，收集滤液。向原消化管中加DPBS再次吹打并过滤，合并滤液，定容至40mL。

（四）细胞收集与计数

9.在4℃，300×g条件下离心5分钟，弃上清。

10.红细胞裂解（可选）：若沉淀中红细胞较多，加入2-5mL红细胞裂解液，室温静置1-2分钟，加DPBS终止裂解，再次离心。

11.用5mL DPBS重悬沉淀，离心洗涤1次，去除残留酶及裂解液。加入1mL DPBS重悬，计数并评估活率。

（五）基质胶混合与接种

12.根据计数结果，使用DPBS将细胞悬液体积调整至5mL，再次离心获得浓缩细胞沉淀。

13.用预冷枪头，将预冷Ceturegel®基质胶与细胞沉淀按1:1体积比轻柔混匀（基质胶终浓度≥70%），调整至每μL基质胶含100-1000个细胞。全程冰上操作，避免气泡。

14.立即用预冷枪头吸取50μL细胞-基质胶混合液，滴加于24孔板孔底中央，确保液滴圆整、不与孔壁接触。

（六）培养与维持

15.将培养板转移至37℃、5% CO₂培养箱，静置孵育15-30分钟至基质胶完全凝固。沿孔壁缓慢加入500μL预热的Cebrary^®肠癌类器官完全培养基，避免冲散胶滴。

16.置于37℃培养箱中继续培养，每2-3天换液，每日镜检观察类器官形成、形态与生长状态。一般3-7天可见类器官形成。

图3. P1培养情况

（七）传代、冻存与复苏

传代：当类器官生长密集、培养基变黄或胶滴出现中心坏死时进行传代。吸去培养基，用PBS洗涤，加入消化液37℃消化5-15分钟，轻柔吹打后加入终止液，300×g离心5分钟，按1:3~1:6比例重新包埋于新鲜基质胶中。

冻存：将消化后的类器官悬液离心，弃上清后加入适量类器官冻存液（41422ES）重悬，调整密度至200–500个/mL，分装至冻存管（1mL/管）。将冻存管置于程序降温盒中，以-1℃/min速率降温至-80℃，24h后转移至液氮中长期保存。

复苏：从液氮中取出冻存管，立即放入37℃水浴快速晃动1–2min至大部分融化。将悬液转移至含5mL预温培养基的离心管中，轻轻混匀，离心后弃上清，再用5mL培养基重悬洗涤一次。最后以适量培养基重悬，与基质胶混合后接种至培养板，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。

注： 操作全程需于生物安全柜或超净工作台内进行。所有与组织及细胞接触的离心管、吸头、筛网等耗材，使用前均需使用专用润洗液进行润洗，以最大限度减少细胞损失与粘附。