土壤微生物研究

长期以来，土壤微生物研究依赖于平板培养、磷脂脂肪酸分析或末端限制性片段长度多态性等方法，存在通量低、分辨率有限的弊端，大量功能微生物被遗漏。培养依赖型方法主要是对细菌、真菌等微生物群落进行培养，以此检测微生物群落的多样性和形态结构，其效果和准确性受到培养基种类影响；而非依赖培养方法则通过直接分析微生物DNA或RNA（如16S rRNA序列、ITS序列、宏基因组学、宏转录组学、扩增子技术等），无需培养过程。

以16S rRNA基因为靶标的高通量测序技术，突破了培养局限，实现了对复杂微生物群落的快速、高分辨率解析。16S rRNA基因存在于所有原核生物中，由保守区和可变区交替排列。保守区可用于通用引物设计，可变区则携带物种特异的进化信息。当前，16S扩增子测序已从单纯的物种组成描述，拓展至群落功能预测、共发生网络构建及标志物筛选等深层分析，成为环境微生物组研究的核心工具。此外，宏组学测序可分析环境样本中的全部DNA或RNA，进一步揭示微生物群落的组成及功能潜力。

图1.土壤和作物微生物组的多样性和功能（图片来源：网，侵删）

不同土地利用方式（耕地、林地、湿地）、施肥制度及污染胁迫均会重塑土壤菌群结构。16S/18S rRNA基因扩增子测序仍是解析群落组成的基础工具，可快速获得土壤中细菌、古菌及真菌的物种丰度与多样性信息。通过高通量测序、宏基因组学及微生物建模技术的突破，研究者可精准描绘土壤微生物的“种群图谱”。

宏基因组测序能进一步揭示群落的功能基因谱，如在污染土壤中可直接检测到多环芳烃降解相关的功能基因簇。基于宏基因组数据构建非冗余基因目录、进行KEGG等功能注释，并重建高质量宏基因组组装基因组（MAGs），可系统评估微生物群落的代谢潜能。2025年发表于Advanced Science的中国农业研究解析了来自全国113个自然田块的4281个细菌MAGs，揭示了关键细菌在养分积累、真菌病原抑制和除草剂生物降解中的作用，从而促进大豆产量。

在群落构建机制研究中，零模型分析可用于区分确定性过程（如环境选择）与随机性过程（如生态漂变）的贡献。研究发现，高盐环境中AMF群落的构建以同质性选择为主，而细菌群落则受生态漂变影响更大，这种差异与微生物的适应策略直接相关。此外，宏转录组与宏蛋白组分析通过分析群落的活性转录本与表达蛋白，可直接反映微生物功能的动态变化。

土壤微生物在农业可持续发展中起着至关重要的作用。通过整合宏基因组数据和理化指标分析，可揭示土壤养分变化如何影响微生物生活史策略，进而指导精准农业中的营养管理策略优化。

去除表层凋落物，采集0–20 cm根际或非根际土壤，过2 mm筛去除杂质，液氮速冻后转-80℃保存。

环境样本富含腐殖酸、金属离子及多糖，是PCR抑制的主要来源。提取策略：推荐采用机械裂解（如锆珠研磨）+化学裂解相结合的提取方案，配套专用磁珠或离心柱纯化，去除抑制剂的同时兼顾革兰氏阳性菌及孢子菌的破壁效率。

根据测序目标选择建库策略：

16S/ITS扩增子建库：采用两步PCR法，靶向V3-V4区或ITS等区域。

宏基因组建库：采用酶切法或超声打断片段化DNA，经末端修复、加A尾、连接接头后PCR扩增。也可以基于Tn5转座酶的“一步法”建库试剂盒可在2.5小时内完成建库，起始量低至1 ng。

宏转录组建库：流程相对复杂：

rRNA去除：总RNA中rRNA占比超过90%，需通过探针杂交去除。

链特异性建库：逆转录合成cDNA第一条链后，第二链合成时以dUTP取代dTTP，保留链方向信息。链特异性文库可提供更精准的基因定量和反义转录本信息。

扩增子测序：Illumina MiSeq/NovaSeq平台，PE250或PE300模式，每个样本建议5-10万条序列。

宏基因组测序：Illumina NovaSeq或DNBSEQ-T7平台，PE150模式，数据量5-10 Gb/样本（物种组成）或10-20 Gb/样本（功能解析）。

全长16S测序：PacBio/ONT平台，读长>1400 bp，直接获取完整可变区信息，分辨率达种水平。

宏转录组测序：Illumina NovaSeq平台，PE150，每个样本10-20 Gb数据。

核心分析内容：

质控与去噪：FastQC、cutadapt、DADA2

物种注释：SILVA、Greengenes、Kraken2、MetaPhlAn4

功能注释：PICRUSt2、HUMAnN3、KEGG、COG

抗性基因分析：ARGs-OAP v3.0

高级分析：共现网络（Cytoscape）、环境因子关联（RDA/CCA）、物种-功能关联：将转录本同时注释物种来源和功能，解析“谁在表达什么基因”。

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