在生物制药质量控制中，宿主细胞残留DNA（HCD）检测是一道不可逾越的"合规红线"。然而，许多实验室在实际操作中频频遭遇"扩增不起来""Ct值漂移""回收率不达标"等困境——问题的根源往往不在PCR试剂本身，而在于样本前处理环节的细节缺失。

一、HCD检测：生物制品质量安全的"第一道防线"

宿主细胞残留DNA（Host Cell DNA, HCD）检测是生物制药质量控制中不可或缺的一环。从单克隆抗体、重组蛋白到疫苗、抗体偶联药物（ADC）与细胞治疗产品，每一款生物制品的申报与放行，都离不开对HCD残留的精准定量。

为什么HCD必须严格管控？生物制品生产过程中使用的宿主细胞（如CHO、HEK293、Vero、E. coli等），即便经过多步纯化，仍可能有微量DNA残留。这些残留的外源DNA可能引发免疫原性、感染性以及致瘤性等潜在风险[1]。因此，在生物药质量控制中，对宿主细胞残留DNA进行检测，是药企必须跨越的"合规红线"。

1.1  2025年版《中国药典》HCD检测要求全面升级

2025年版《中国药典》已于2025年3月由国家药监局、国家卫生健康委颁布（2025年第29号公告），自2025年10月1日起正式施行[2]。在生物制品质量控制方面，新版药典进一步强化了HCD检测的要求，尤其针对CHO细胞表达的重组蛋白药物（如单抗、ADC等）。

表1  2020版与2025版《中国药典》HCD检测要求对比

1.2  全球主要监管机构HCD残留限度要求

各国监管机构对HCD残留量均有明确规定。表2汇总了主要监管要求：

表2  全球主要监管机构HCD残留限度要求

除总量控制外，DNA片段大小同样是风险评估的关键指标。研究表明，一个功能基因至少在200 bp以上，因此大于200 bp的DNA片段可能具有致病性，残留DNA片段越大，生物制品的风险等级越高[3]。WHO和FDA均建议宿主细胞残留DNA长度不超过200 bp。

1.3  主流HCD检测方法比较

《中国药典》2025年版通则3407中列出了三种方法：DNA探针杂交法、荧光染色法以及定量PCR法。qPCR法因其高灵敏度、高特异性（可区分不同宿主来源）和高通量优势，已成为HCD检测的主流方法。2025版药典在多个新增药物中明确指定使用qPCR法，表明该方法已成为行业主流趋势[2]。

 

二、样本前处理：HCD检测中最被低估的关键环节

2.1  复杂基质：扩增的"头号干扰源"

生物制品的样本基质远比普通科研样本复杂。无论是细胞培养上清、纯化中间体还是终产品原液，都含有大量可能干扰核酸提取和PCR扩增的物质。表3总结了主要干扰类型及其机制：

表3  生物制品样本中主要PCR干扰物质及作用机制

2.2  前处理中的常见误区

很多实验室沿用常规核酸提取流程做HCD检测，却忽略了HCD样本的特殊性——目标DNA含量极低（pg–fg级）、基质干扰极强。以下是几个最常见的误区：

误区一：忽略样本预处理，直接上样提取。 细胞培养上清未离心去除碎片、高浓度蛋白样本未稀释、含脂类样本未脱脂——这些"节省时间"的操作，让提取从一开始就陷入低回收率的困境。

误区二：提取方法选择不当。 柱式法对微量HCD的结合容量有限，且难以彻底去除高浓度蛋白与盐离子；磁珠法若操作不规范（磁珠用量不足、孵育时间过短、洗涤不彻底），同样会导致回收率低下。

误区三：忽略载体DNA的保护作用。 对于fg级的超微量HCD，DNA极易吸附于管壁和磁珠表面而损失。适量载体DNA（如鲑鱼精DNA）可有效保护目标DNA，减少提取过程中的损失[4]。

误区四：试剂与耗材的隐性污染。 提取试剂中残留的核酸酶或抑制物、耗材中残留的去污剂，都可能直接导致扩增失败。

三、解决方案：从源头破解HCD扩增难题

3.1  磁珠法前处理的核心优势

相比柱式法，磁珠法在HCD检测前处理中具有显著优势：

表4  柱式法与磁珠法在HCD前处理中的对比

3.2  全流程解决方案的关键技术参数

以前处理试剂盒为例，其核心性能指标如下：

表5  HCD前处理试剂盒关键性能指标

配套的HCD qPCR检测试剂盒采用荧光探针原理，可专一快速检测200 bp以下及以上的宿主细胞DNA残留，定量限可达 fg/μL级别，扩增效率90%–110%，批内重复性CV < 10%。试剂盒参考ICH Q2(R2)分析方法验证指导原则[5]，并按照EP 2.6.7、JP G3和USP <509>药典要求进行验证[6][7][8]。

3.3  双方案并行：手动与自动化灵活适配

针对不同通量与场景需求，翌圣提供"手动提取 + 自动化仪器提取"双方案：手动方案适用于小批量与研发阶段的灵活操作，自动化方案则面向中高通量、常规放行检测场景。两者共享同一磁珠法试剂盒体系，确保方法转移时的数据一致性，客户可根据实际需求灵活选择。

 

图1  HCD样本前处理：手动与自动化双方案

在自动化方案中，预封装磁珠法前处理试剂盒可配套16通道、48通道、96通道核酸提取仪，实现核酸的高通量提取。仪器内置负压HEPA排气过滤与紫外消毒模块，有效防止样本间交叉污染，全流程运行将提取时间缩短至30分钟，并消除人为操作误差、提升批间重复性。

更进一步，集样本核酸提取和PCR扩增检测于一体的全自动化核酸提取检测一体机，可实现"样本进，结果出"的全流程自动化，将PCR实验室浓缩到不足2平方米的空间内，兼顾检测效率与核酸污染控制。无论选择手动还是自动化方案，均能获得稳定可靠的HCD检测结果。

四、方法学验证：确保数据可靠的关键

任何HCD检测方法在正式使用前，都必须经过全面的方法学验证。根据药典及ICH Q2(R2)要求[5]，验证应涵盖以下核心指标：

表6  HCD检测方法学验证指标体系

实际操作中建议的质控流程：

● 回收率验证：每批次样本加入已知量HCD标准品，计算回收率，确保在70%–130%之间。

● 抑制性验证：提取后的样本进行梯度稀释检测，若稀释后Ct值呈线性下降，说明无明显抑制。

● 空白对照：设置提取空白与PCR空白，确保无外源DNA污染。

● 重复性验证：同一样本多次提取检测，Ct值CV需 ≤5%。

五、总结：从"扩增困境"到"精准可控"

HCD检测的"扩增不起来"，从来不是无解的难题——问题往往出在样本前处理环节的细节缺失与方法不当。把前处理做扎实，扩增困境就能转为精准可控。

从监管趋势看，2025年版《中国药典》已全面升级HCD检测要求：适用范围扩大至多个单抗和ADC类药物，检测方法明确指定为qPCR法，部分产品残留限值收紧至 ≤10 pg/mg。而qPCR法虽灵敏度高，但对样本纯净度最为苛刻——高浓度蛋白、盐离子、去污剂等干扰物质若未在前处理中彻底清除，再好的试剂也无从发挥。

当样本前处理真正做到"基质净化彻底、DNA回收高效、污染控制严格"时，HCD检测便从"扩增困境"走向"精准可控"——Ct值清晰、曲线平滑、fg级检出稳定、批内CV < 10%。

在2025年版《中国药典》正式施行的今天，专业化、标准化、适配化的前处理方案，正是药企跨越HCD"合规红线"、实现精准可控的核心钥匙。

参考文献

[1] WHO Technical Report Series 978, Annex 3. Recommendations for the evaluation of animal cell cultures as substrates for the manufacture of biological medicinal products and for the characterization of cell banks. World Health Organization, 2013.

[2] 国家药监局, 国家卫生健康委. 关于颁布2025年版《中华人民共和国药典》的公告（2025年第29号）. 2025年3月.

[3] FDA Guidance for Industry: Considerations for the Design of Early-Phase Clinical Trials of Cellular and Gene Therapy Products. 2013.

[4] USP General Chapter <509> Residual DNA Testing. United States Pharmacopeial Convention.

[5] ICH Harmonised Guideline Q2(R2): Validation of Analytical Procedures. Adopted 1 November 2023.

[6] European Pharmacopoeia 11.0, Chapter 2.6.7: Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT).

[7] Japanese Pharmacopoeia 18th Edition, General Information G3: Nucleic Acid Amplification Techniques.

[8] USP General Chapter <1130> Nucleic Acid-Based Techniques—Approaches for Detecting Trace Nucleic Acids (Residual DNA Testing).

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