在生物制品质量控制中，宿主细胞残留DNA（HCD）检测早已不是新鲜话题。然而，越来越多的研发与质控人员发现：仅检测HCD总残留量，已无法满足日益严格的监管要求。"有没有"之外，"有多大"正在成为决定产品能否获批的关键变量。

一、为什么"总量达标"不等于"风险可控"？

HCD是生物制品生产过程中宿主细胞（如CHO、HEK293、Vero、E. coli等）裂解后残留的DNA杂质，属于典型的工艺相关杂质。长期以来，行业的标准做法是：用qPCR检测HCD总残留量，只要低于药典或指导原则的限值（如细胞基质生物制品≤100 pg/剂），就认为风险可控。

但问题在于：同样是10 ng残留，全部是50 bp的小片段，和混杂着500 bp的大片段，风险截然不同。研究表明，一个功能基因的长度至少在200 bp以上，大于200 bp的DNA片段有可能携带完整的致瘤基因、病毒相关序列[1]。残留DNA片段越大，生物制品的风险等级越高。

具体而言，大片段HCD（>200 bp）可能带来三类核心风险：

● 潜在致瘤风险（Tumorigenicity）：大片段DNA更可能携带完整的致瘤基因（如ras、myc）。越小的片段风险越低，通常<200 bp被认为难以提供完整功能基因[2]。

● 潜在感染风险（Infectivity）：部分动物细胞可能携带潜伏病毒，其基因组若未充分破碎，仍有理论上的感染可能。

● 潜在免疫刺激风险（Immunogenicity）：CpG富集区域可被TLR9受体识别，诱发不必要的免疫反应[1]。

表1  残留DNA片段大小与风险等级

 

二、监管要求：从"总量控制"到"片段控制"的明确升级

HCD片段大小控制经历了数十年的科学论证与监管演进。风险认知始于1954年，美军流行病学委员会（AFEB）提议禁用致瘤细胞系制备人用疫苗，担忧残留DNA存在致癌隐患[2]；此后四十余年间，学术界对此长期存有争议。关键转折出现在2006年，WHO细胞基质研究小组达成共识，认为将残留DNA片段控制在200 bp以下，可通过减少完整基因序列的存在概率，降低致瘤和感染风险—这是国际层面首次将片段大小明确为风险控制指标[1]。此后，各国监管机构相继将其纳入法规框架：

美国FDA在《Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)》行业指南中明确建议：将非致瘤性连续细胞的残留DNA量限制在10 ng/剂以下，DNA大小限制在约200 bp以下[3]。

中国CDE于2022年5月发布的《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》中明确规定："需对DNA残留量和残留片段大小进行控制"，"如有可能，建议尽量将DNA残留片段的大小控制在200 bp以下"[4]。该指导原则首次将残留DNA片段大小的控制要求以明文形式纳入国内法规体系。

WHO与美国FDA现行指导方针同样推荐成品中残留DNA不高于10 ng/剂，片段长度不超过200 bp[1][3]。2025年版《中国药典》进一步强化了HCD检测要求，明确指定采用qPCR法作为主流检测方法[5]。

表2  全球主要监管机构对HCD片段大小的要求

 

简单说：只测总量是"及格线"，同时测片段分布才是"安全线"。对于使用致瘤细胞系或基因治疗产品，片段分布检测已从"可选项"变为"必答题"。

三、忽略片段分布，会在哪里"踩坑"？

3.1  工艺优化：缺少数据支撑

下游纯化工艺（层析、超滤等）的核心目标之一是去除HCD。但如果只看总残留量，你根本不知道工艺到底"清掉了什么"—是去掉了大片段，还是只筛掉了小片段？

举例：某批次总残留从100 pg降至10 pg，看似进步；但如果残留中500 bp片段的占比从10%升至30%，风险实际上反而升高了。只有片段分布数据才能告诉你工艺是否真正"清掉了危险的大片段"。

3.2  合规申报：易被发补

如今申报生物制品，CDE、FDA的发补意见中"补充HCD片段分布数据"越来越常见。许多企业前期只做了总量检测，到申报阶段才被要求补做片段分析，不仅要重新梳理工艺、补充验证，成本直接翻倍。提前布局片段分布检测，能让申报路径更顺畅。

3.3  产品安全：隐性风险不容忽视

尤其是基因治疗、细胞治疗这类直接作用于人体基因组的产品，大片段HCD残留的潜在致瘤、感染风险直接关系到患者安全。片段分布检测是这类产品安全性评价中不可或缺的一环。

四、片段分布检测，怎么做？

目前行业常用的方法主要有两种：毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光法（CGE-LIF）和荧光探针qPCR法。表3对比了两种方法的差异：

表3  CGE-LIF法与qPCR法对比

qPCR法通过设计不同长度的特异性引物探针，覆盖 <100 bp、100–200 bp、200–500 bp、>500 bp 等关键区间，刚好覆盖"200 bp安全阈值"的判断需求，是兼顾效率、成本和合规性的优选方案[6]。

五、翌圣生物HCD片段分析解决方案

翌圣生物依托自主研发的qPCR技术平台，推出宿主细胞残留DNA片段分析试剂盒系列，覆盖CHO、HEK293、Vero等多种主流宿主细胞。

5.1  精准覆盖关键片段

试剂盒采用qPCR荧光探针原理，针对性设计4组特异性引物探针，覆盖从<100 bp到>500 bp的关键区间，直接判断大片段（>200 bp）残留是否超标。以CHO片段分析试剂盒为例，4个扩增片段分别为88 bp、115 bp、229 bp、505 bp，精准横跨200 bp安全阈值两侧。

表4  翌圣生物HCD片段分析试剂盒产品系列

5.2  性能验证：有据可依

以CHO片段分析试剂盒（41334ES）为例，其核心性能指标如下：

表5  HCD片段分析试剂盒关键性能指标（以CHO为例）

该试剂盒含有四种不同长度的扩增片段（88 bp、115 bp、229 bp、505 bp），需分别针对这四个片段设置标曲。四片段线性范围均为30 fg/μL~300 pg/μL，R²>0.99，扩增效率在90%~110%之间，各浓度检测值CV<15%，标准曲线与扩增曲线线性良好。

5.3  全流程配套

试剂盒可与磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒（18461ES/18462ES）配套使用，也可搭配全自动核酸提取仪实现"样本进，结果出"的全流程自动化，满足从研发到放行的不同通量需求。

结语：从"总量合规"到"片段安全"

生物医药行业的质量控制，永远在向"更精准、更安全"升级。HCD片段分布检测不是额外负担，而是保障产品安全、助力合规申报、优化工艺效率的核心工具。

从监管时间线看：1954年AFEB首次提出致瘤细胞系的安全顾虑；2006年WHO将片段大小纳入风险控制指标；2022年CDE明确要求"对DNA残留量和残留片段大小进行控制"；2025年版《中国药典》进一步强化HCD检测要求——从"总量合规"走向"片段安全"，已是不可逆转的行业趋势。

翌圣生物HCD片段分析试剂盒系列，以精准的片段覆盖、可靠的性能验证、完善的全流程配套，帮助生物医药企业轻松应对监管升级，让产品质量更可控、申报更顺畅、安全更有保障。

 

翌圣生物制品质量安全控制整体解决方案

翌圣生物搭建覆盖基因治疗、细胞治疗、mRNA、抗体药、疫苗全赛道的质控产品矩阵，完整覆盖宿主核酸残留、宿主蛋白残留、工艺杂质、微生物污染、细胞表征等全维度检测需求，为生物制药企业提供从研发到商业化的一站式质控解决方案。

 

参考文献

[1] WHO. Recommendations for the evaluation of animal cell cultures as substrates for the manufacture of biological medicinal products and for the characterization of cell banks. WHO Technical Report Series 978, Annex 3, 2013.

[2] Peden K, Sheng L, Lewis AM. Oncogenicity of DNA in vivo: Tumor induction with expression plasmids for activated H-ras and c-myc. Biologicals, 2008. (历史背景：1954年美军流行病学委员会AFEB提议禁用致瘤细胞系制备疫苗)

[3] FDA. Guidance for Industry: Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs).

[4] 国家药品监督管理局药品审评中心. 体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）. 2022年5月.

[5] 国家药监局, 国家卫生健康委. 关于颁布2025年版《中华人民共和国药典》的公告（2025年第29号）. 2025年3月.

[6] ICH Harmonised Guideline Q2(R2): Validation of Analytical Procedures. Adopted 1 November 2023.

 

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