原料分享 | 感染性疾病诊断方案，PCR、LAMP、NGS超全原料选择！
分子诊断技术在感染性疾病，尤其是在全球应对新型冠状病毒大流行中发挥了重要作用，高灵敏度和高特异度的核酸扩增试验，已成为诊断各种病毒感染的参考标准。
2023年，中华检验医学培训工程专家委员 会联合中华医学会呼吸病学分会，邀请我国呼吸、感染、临床微生物检验和分子检验等领域专家，共同制定了 《成人呼吸道感染病原诊断核酸检测技术临床应用专家共识 ( 2023) 》。该共识对实时荧光PCR、等温扩增、病原体高通量测序等不同分子诊断技术的特点和适用范围，以及该类技术在不同类型成人呼吸道感染疾病中的应用策略给出了明确推荐意见，以期更好地指导临床实践。
翌圣感染性疾病检测解决方案
感染性疾病由病毒、细菌、真菌或寄生虫等病原体引起，其快速传播和广泛影响构成了全球公共卫生领域的重大挑战。快速、准确、有效的识别病原体尤其关键。
翌圣生物在酶原料领域深耕多年，长期为IVD企业提供高品质、高性价比的原料，针对感染性疾病诊断的荧光定量PCR、等温扩增、高通量测序等技术均有相应的解决方案，可为临床诊断试剂盒开发提供性能优越、稳定的酶原料。
荧光定量PCR技术是世界各国疾控中心（CDC）采用的金标准，可以检测患者样本中微量病原体，是传染病病毒传播早期诊断的主要方法。翌圣ZymeEditor™酶改造平台针对不断提升的应用需求，全方位定向改造了Taq DNA 聚合酶、逆转录酶等，同时使用独特的超低残留去除技术，严格控制原料中宿主核酸残留及背景菌残留水平，配合优化的PCR缓冲体系，可稳定供应各类超洁净、高性价比的通用液体版预混液，支持引物探针全预混的“一管式”试剂，适配性更灵活的可冻干的预混液以及单酶原料等，为病原微生物的检测准确性、高效性保驾护航。
部分产品推荐
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产品类型 |
产品功能 |
产品名称 |
货号 |
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qPCR mix |
快速、全预混、低残留 |
Hieff Unicon® Universal Superfast qPCR Mix（One Tube） |
16924ES |
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全预混、低残留 |
Hieff Unicon® Pure Pro U+ qPCR Mix（One Tube） |
16713ES |
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全新3代通用全预混 |
16710ES |
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高灵敏通用（5×浓度） |
Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix（UDG plus） |
13891ES |
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高灵敏通用可冻干 |
Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix（UDG plus） |
11893ES |
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RT-qPCR mix |
耐抑制快速 |
Hifair® Universal Advanced Multiplex One Step RT-qPCR Mix (UDG Plus) |
16930ES |
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高灵敏通用快速 |
Hifair® C203P1 Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit（UDG Plus） |
16630ES |
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高浓度一管式 |
Hifair® Advanced One Step RT-qPCR Probe Mix（UDG Plus） |
16921ES |
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全预混通用 |
11899ES |
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通用快速可冻干 |
Hifair® Lyo-Ready I Multiplex One Step RT-qPCR Kit（UDG plus) |
16645ES |
等温扩增技术（Isothermal Amplification Technology, IAT）因其无需专用的仪器设备、扩增时间短、灵敏度高等特点，在现场检测和即时诊断中显示了良好的应用前景。其中环介导等温扩增（loop mediated isothermal amplification,LAMP）是当前最常见、应用最广泛的等温扩增技术，其使用具有链置换特性的Bst DNA聚合酶，在60-65℃条件下高效、快速、特异性扩增靶标序列，可在15-60 min内实现109-1010倍的扩增。相较需要在60-65℃条件下进行扩增的LAMP技术，重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）作为一种新型核酸恒温扩增技术成为当前的研究热门，其可在37~42 ℃条件下，10-30 min内实现待测靶标的快速检测。翌圣生物针对LAMP及RPA试剂盒开发也有相关酶原料及预混体系可供选择，助力下游客户检测体系的快速搭建。
部分产品推荐
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产品类型 |
产品功能 |
产品名称 |
货号 |
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LAMP试剂 |
荧光染料法 |
RT-LAMP Fluorescent Assay Kit(Bst Plus HSS) |
16729ES |
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染料法可冻干 |
RT-LAMP Lyo-Ready Fluorescent Assay Kit(Bst Plus) |
16730ES |
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pH指示剂法 |
RT-LAMP pH Sensitive Dyestuff Kit |
13906ES |
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pH法可冻干 |
RT-LAMP pH Sensitive Dye Chromogenic Version Freeze-Dryable Kit |
13920ES |
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Bst酶 |
含甘油 |
Hieff® Bst Plus DNA Polymerase (40 U/μL) |
14402ES |
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冻干粉饼 |
Lyophilized Bst Plus DNA Polymerase (60 U/μL，Glycerol-Free) |
14405ES |
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耐高温（70℃） |
Hieff® Super Bst DNA Polymerase(2,000 U/μL) |
14410ES |
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温启动Bst酶 |
Hieff® WS Bst DNA Polymerase(40 U/μL) |
14412ES |
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核糖核酸内切酶 |
探针法LAMP |
RNase HII (2 U/μL) |
14539ES |
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RPA Kit （冻干粉） |
荧光型RPA （Exo探针法） |
DNA Lyo Rapid Isothermal Amplification Kit（Fluorescent） |
16904ES |
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荧光型RT-RPA（Exo探针法） |
RNA Lyo Rapid Isothermal Amplification Kit（Fluorescent） |
16905ES |
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层析型RPA （Nfo探针法） |
DNA Lyo Rapid Isothermal Amplification Kit（Chromatographi） |
16906ES |
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层析型RT-RPA（Nfo探针法） |
RNA Lyo Rapid Isothermal Amplification Kit（Chromatographi） |
16907ES |
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电泳型RPA |
DNA Lyo Rapid Isothermal Amplification Kit (Basic) |
16908ES |
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电泳型RT-RPA |
RNA Lyo Rapid Isothermal Amplification Kit (Basic) |
16909ES |
感染性疾病检测一直是大家关注的领域，面对不明原因感染、多重感染等情况，NGS的高通量相对荧光定量PCR及等温扩增的优势即凸显出来了。虽然mNGS、tNGS和共建库等从技术到产品不断推陈出新，但时效性、检出率和低背景菌残留一直是大家的极致追求。翌圣生物经过匠心研发，开发出一系列超快速、高效率和低残留产品解决方案，助力病原微生物快速、精准诊断。
部分产品推荐
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技术类型 |
产品类型 |
产品名称 |
货号 |
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mNGS |
DNA&RNA共提取 |
MolPure® Magnetic Pathogen DNA/RNA Kit |
18306ES |
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机械法建库 |
Hieff NGS® Ultima DNA Library Prep Kit |
13489/13508ES |
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酶切法建库 |
Hieff NGS® OnePot Flash DNA Library Prep Kit |
12316ES |
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Total RNA建库 |
Hieff NGS® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit |
12308ES |
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cDNA酶切法建库 |
Hieff NGS® ds-cDNA Synthesis Kit |
13488ES/13501ES |
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Hieff NGS® OnePot Flash DNA Library Prep Kit |
12316ES |
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共建库 |
cDNA酶切法建库 |
Hieff NGS® Rapid DNA&RNA Library Co-Prep Kit |
12971ES |
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dscDNA酶切法建库 |
Hieff NGS® ds-cDNA Synthesis Kit+Hieff NGS® OnePot Flash DNA Library Prep Kit |
13488+12316ES |
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tNGS |
逆转录 |
12950ES |
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12946ES（快速版） |
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多重PCR |
4×Hieff® Multiplex PCR Master Mix |
12948ES |
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12947ES（UDG版） |
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一步法RT-PCR |
4×Hieff® Multiplex RT-PCR Master Mix |
12950ES |
部分产品性能
Hieff Unicon® Universal Superfast qPCR Mix（One Tube）（Cat#16924ES）
产品优势
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支持快速程序：支持快速程序，20min即可出结果；
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超强全预混稳定性：预混引探37℃放置7天，反复冻融20次性能稳定；
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背景残留低：大肠、铜绿及人源基因组DNA残留48孔无检出；
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试剂通用性好：适配多类型多重引探（已验证超40种不同类型靶标），均能稳定扩增；
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灵敏度高特异性好：灵敏度达200 copies/mL，48孔阴性不起峰；
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dUTP/UDG防污染体系：引入了dUTP/UDG防污染系统，可有效防止气溶胶污染；
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多平台多体系适用： Bio-Rad CFX96、ABI Q5、7500、SLAN、天隆等仪器均适配。
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快速扩增，性能优越
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仪器 |
SLAN |
体系 |
25 μL总体系，其中模板5uL |
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模板 |
细菌质粒模板（B管、P管） |
模板浓度 |
Ct30-35 灵敏度测试时模板稀释到掉孔浓度附近 |
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扩增程序 |
96S/48S常规：95°C 5 min；40 cycles (95°C 15sec；60°C 30 sec)--50min 48S快速：95°C 15 sec；40 cycles (95°C 2sec；60°C 8 sec)--20min |
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表1. 16924不同程序灵敏度测评
图1.16924和市面上同类产品Supplier A常规程序和快速程序测评
结论：使用16924和市面上同类产品（Supplier A）检测两组4重质粒模板（B管和P管），在较高浓度（Ct30-35）时，Supplier A检测P管模板时出现快速程序较常规程序两个通道Ct值延后1以上，16924在常规程序和快速程序上Ct值无显著差异，快速程序上部分靶标Ct提前明显（如图2）。在灵敏度测评时，16924快速程序和常规程序的检测Ct值、检出率均无显著差异（如表1）。
Hifair® Lyo-Ready I Multiplex One Step RT-qPCR Kit（UDG plus)（Cat#16645）
产品优势
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支持冻干：冻干后依然保持酶活性完整，性能和液体试剂一样；
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灵敏度高：5 copies/T可稳定检出；
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稳定性好：含引物探针的冻干球，在50℃热加速33d，性能不受影响；
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支持快速程序：快速程序下性能不受影响，30min即可出结果；
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dUTP/UDG防污染体系：引入了dUTP/UDG防污染系统，可有效防止气溶胶污染。
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加速实验后性能验证
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仪器 |
7500 |
体系 |
25 μL |
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模板 |
转录RNA模板 |
模板浓度 |
105、104、103 copies/uL及1 copy/uL |
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对照组 （红色曲线） |
20uL体系冻干（含引物探针），立即取1颗冻干球加20uL无酶水，5uL模板。 |
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实验组 （蓝色曲线） |
20uL体系冻干（含引物探针），冻干球于50℃放置30天，取1颗冻干球加20uL无酶水，5uL模板。 |
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程序 |
50°C 2 min；95°C 30 sec；40 cycles (95°C 5sec；60°C 10 sec) |
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图2. 16645冻干球性能及稳定性测试
结论：将含HPIV引物探针的16645体系按说明书上冻干工艺和条件进行冻干，冻干球在50℃条件下加热30天，与同批次刚出箱冻干球相比，扩增曲线峰形、Ct值、低浓度检出率（1copy/uL，20个重复，检出率均为100%）均没有差异，冻干球稳定性好。
