一篇文章读懂RPA不同检测方法

 

重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技术自2006年由Piepenburg等首次报道以来，作为一种新型核酸等温扩增方法，在分子诊断领域受到广泛关注。该技术在恒温条件下（37–42℃）即可完成核酸快速扩增，无需热循环设备，操作简便，检测时间短，灵敏度高，适用于现场快速检测和资源有限地区的应用。

随着RPA技术的不断发展，多种检测方法相继建立，可满足不同应用场景对检测灵敏度、特异性、通量以及操作便捷性的要求。本文将从RPA的技术原理入手，对主流的检测方法进行梳理，为相关研究和应用提供参考。

 

一、RPA技术原理

RPA技术的设计灵感来源于T4噬菌体的DNA复制机制，其反应体系主要依赖三种核心蛋白：重组酶（T4 UvsX）、单链结合蛋白（T4 gp32）和链置换DNA聚合酶（如Bsu DNA聚合酶）。

 

RPA扩增过程可分为以下几个步骤：

 

重组酶-引物复合体形成：在ATP存在下，重组酶UvsX与引物结合形成复合物，辅助因子UvsY可促进UvsX与单链DNA的结合，提高链交换反应效率。

 

靶点识别与链侵入：重组酶-引物复合物在双链DNA中扫描并识别同源序列。一旦定位成功，复合物插入双链DNA形成D环结构，启动链置换反应，被置换的单链立即与单链结合蛋白gp32结合，防止其重新形成双链。

 

扩增启动：重组酶从复合物中水解，引物3'端暴露，链置换DNA聚合酶结合并启动延伸，合成新的互补链。这一过程循环往复，实现目标序列的指数式扩增。

 

图1 RPA等温扩增技术原理图

 

 

二、RPA扩增产物的主要检测方法

1. 琼脂糖凝胶电泳法

琼脂糖凝胶电泳是RPA产物最基础的检测方式。由于RPA反应体系中包含多种酶和蛋白质，直接进行电泳会产生干扰，因此需对扩增产物使用酚-氯仿法纯化，去除蛋白后再进行琼脂糖凝胶电泳。

 

2. 实时荧光法

实时荧光检测是RPA技术中最常用的检测方式之一，根据所用酶和探针的不同，主要分为exo探针法和fpg探针法两种类型。

 

（1）exo荧光探针法

exo荧光探针法需要在反应体系中加入核酸外切酶Ⅲ（exonuclease Ⅲ）和特异性荧光标记的exo探针。exo探针包含一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，分别连接在相邻的T碱基上（中间相隔1–5个碱基），两基团之间设计有一个四氢呋喃（THF）位点，探针3'端需添加阻断基团以防止延伸。

当探针与目标序列特异性结合时，THF位点被核酸外切酶Ⅲ识别并剪切，荧光报告基团与淬灭基团分离，荧光信号得以释放。随着扩增进行，荧光信号同步积累，可通过荧光检测设备实时监测扩增曲线，实现对靶标的定量分析。

 

 

图2 exo探针法检测原理图

 

（2）fpg荧光探针法

fpg荧光探针法采用甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶（Formamidopyrimidine DNA glycosylase，Fpg）替代核酸外切酶Ⅲ。fpg是一种兼具DNA糖基化酶和AP裂解酶活性的酶，可识别并切割DNA中的氧化损伤位点（如8-氧代鸟嘌呤）。在RPA-fpg系统中，探针设计包含特定的损伤位点，当探针与靶序列结合后，Fpg识别并切割该位点，使荧光基团与淬灭基团分离，产生可检测的荧光信号。