Exosome（外泌体）是由活细胞分泌的直径约为30-150 nm的小囊泡，具有典型的脂质双分子层结构，存在于细胞培养上清液、血清、血浆、唾液、尿液、羊水以及其它生物体液中。Exosome携带有多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息，不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用，更有望成为多种疾病的早期诊断标志物。

该血清/血浆外泌体快速提取纯化试剂盒，组分经过优化处理，适用于血清/血浆中的外泌体提取，可快速高效地获得高纯度外泌体颗粒。本试剂盒采用独特的分离技术，可以快速从血清/血浆中获得大量完整的外泌体颗粒，适用于下游的细胞共培养、电镜分析、WesternBlot、荧光定量（qPCR）和高通量测序等应用。

产品组分

适用于血清/血浆中的外泌体提取，快速高效地获得高纯度外泌体颗粒。

操作方法

一、样本预处理

1.离心机在使用前先于4 ℃预冷10 min；

2.取样：如果是冻存样品，从冰箱取出后于2-8 ℃条件下进行解冻；如果是新鲜样品，收集样品后置于2-8 ℃保存；

3.血清/血浆样本于4 ℃，10,000×g离心10 min，然后将样本按照500μL/管进行分装，不足部分用1×PBS 补足至500μL。

二、除杂蛋白

1.从冰箱中取出预冷的Solution A置于碎冰上；

2.加Solution A：在500μL血液样本中加入400μL预冷的Solution A，立即将离心管盖紧，通过涡旋振荡器充分混匀30 s（要迅速拿去离心）；

3.离心去除杂蛋白：将混匀后的样品于4 ℃，10,000×g离心20 min，去除沉淀；

4.上清液转移：去除杂蛋白的离心上清液转移至新的1.5 mL离心管中；

三、沉淀外泌体

1.加Solution B：在去除杂蛋白后的离心上清液中加入120μL的Solution B；

2.溶液混合：加入Solution B试剂后将离心管盖紧，通过涡旋振荡器充分混匀2 min；再放置于室温下静置5 min；

3.沉淀外泌体：将装有混合液的离心管于4 ℃以10,000×g离心15 min，弃上清；

4.再次离心：将含有沉淀的离心管再次于4 ℃以10,000×g离心2 min，弃上清（注：尽可能吸净上清液），并将1.5 mL离心管于室温下敞口静置10 min；

5.外泌体重悬：加入200μL的1×PBS用移液器反复吹打或漩涡混合均匀（或者4℃浸泡过夜），彻底溶解沉淀，此重悬液中含有提取的完整外泌体。

6.收获外泌体颗粒：将含有重悬液的1.5 mL离心管于4 ℃以10,000×g离心5 min，保留上清液，该上清液中富含外泌体颗粒。 （注：此时可能有较多沉淀，为正常现象）

四、外泌体纯化

1.外泌体纯化：将收获的外泌体颗粒粗品转入 Exosome Purification Filter(EPF柱)上室中，于 4℃，3,000×g离心 10 min（可适当延长离心时间至液体全部富集管底），EPF柱管底的液体即为提取的外泌体；（注：EPF 柱不可重复使用）

2 .外泌体的保存：纯化后的外泌体以50-100μL进行分装保存于-80 ℃低温冰箱中，以备后继实验使用。

注意事项

1. 使用前请将外泌体抽提试剂（41216-A）充分混匀。
2. 产品只针对血清/血浆样本，不适用其它体液或者是细胞培养上清中外泌体的抽提；如果需要进行细胞上清外泌体分离，请选用细胞培养上清外泌体快速抽提试剂盒。
3. 如果想要进一步纯化外泌体，可以使用相应抗体包被的磁珠进行亲和纯化。

本试剂盒室温下运输，室温或2-8 ℃下保存12个月（按照试剂盒不同成分分别保存），使用前请充分混匀。

Q:  41216ES和41206ES有什么区别？

A:  41216ES是升级款。升级款多加了除杂蛋白的试剂solution B，除杂蛋白的效果明显。结果上来说，同样的样品41216ES提取的蛋白浓度会低一些，但是纯度会高一些。两款试剂盒都是共沉淀法，做蛋白质组学推荐41216ES新款试剂盒。新款试剂盒对杂蛋白的效果更好，对下游实验的影响也小。

Q: 外泌体提取时，为什么需要二次重复离心，彻底去除上清？

A：血清或血浆中含有大量蛋白质，彻底去除以防止对提取的外泌体造成更多 蛋白质污染。

Q：提取的外泌体如何保存？

A：短时间内使用，可在 2-8℃保存一周，若长时间保存，建议放在-80℃冰箱 中，避免反复冻融，另外，最好是使用低吸附蛋白的保存管。

Q：重悬的外泌体颗粒不能通过或部分通过纯化柱，如何处理？

A：由血清或血浆等样品提取的外泌体含有较多的污染蛋白质，离心经过纯化 柱时可能会堵塞过滤膜，所以，重悬时需要多次吹打，彻底溶解沉淀，然后在经过纯化柱纯化。

Q：如何鉴定提取的外泌体？

A：外泌体是体细胞分泌的细胞外囊泡群体中一种，直径一般为 30-150nm，通 常确定外泌体一般需要三个条件：电镜形态观察，颗粒粒径测定和蛋白标志物检测（Western Blot 检测 CD9，CD81，CD63，Alix，TSG101 等）。

Q:本试剂盒提取外泌体方法与超速离心方法相比有哪些优势？

A:主要表现在：操作简单，不需要额外仪器设备，节省时间，可小体积样本提取等。