Exosome（外泌体）是由活细胞分泌的直径约为30-150 nm的小囊泡，具有典型的脂质双分子层结构；存在于细胞培养上清液、血清、血浆、唾液、尿液、羊水以及其它生物体液中；Exosome携带有多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息，不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用，更有望成为多种疾病的早期诊断标志物。

本试剂盒采用独特的分离技术 ，组分经过优化处理，适用于乳液中的外泌体提取，可快速高效地获得外泌体颗粒，可用于电镜分析、NTA粒径分析、核酸分析、蛋白分析、细胞学实验和动物实验等。

组分信息

该试剂盒适用于牛奶、羊奶、马奶、驼奶等初始乳液，不建议奶粉样本提取。

使用说明

1. 样本预处理

（1）取样：如果是冻存样品，从冰箱取出后于 25℃水浴中进行解冻，将完全融化后的样品置于冰上，如果是新鲜样品，收集样品后置于冰上；

（2）样品初始用量：单次提取时的乳液量建议 25-50 mL；

（3）离心去脂：将样品转移至离心管中，于 4℃以 10,000 ×g离心 30 min，去除样品中的脂质及部分蛋白（注：离心后样品分为三层，上层为脂质层，下层为蛋白沉淀，中间层为乳清。离心后上层状态为 “致密、稳定、不易脱落”，若上层“松软、易脱落” 且下层沉淀较多，可重复此步骤，每次离心取中间层液体）；

（4） 乳清转移：将去除脂质的乳清（中间层液体）转移至新的 50 mL 离心管中（注：可用枪头将上层脂质戳破后缓慢倾倒，或用移液器转移，转移后的乳清中带有少量脂质和沉淀是正常现象，不影响后续实验）。

2. 去除杂蛋白

（1) 乳清澄清：乳清中加入 Solution A，将离心管颠倒混匀，再加入 Solution B，颠倒混匀后于 2-8℃ 静置 5 min；（注：静置完成后轻轻晃动离心管，呈现“豆花状”固体，液体部分为“透明状”。若未呈现“豆花状”，可再适当加入 Solution B 至混匀后轻晃管壁有“豆花状”)；

注：具体加入试剂A,B用量，可根据上表等比例换算。

（2) 乳清澄清：离心去杂蛋白：将澄清后的乳清于4 ℃以10,000×g离心20 min，收集上清液；(注：若上清可见白色颗粒，建议复此步骤，避免下一步离心过滤困难。)

（3) 上清液过滤：将收集的上清液转移至50 mL离心过滤柱中，于4 ℃以3000×g离心 10 min;  (注：若未过滤完，可重复离心至上层液体全部离下来为止。）

（4) 缓冲体系平衡：将过滤后的上清液转移至新的50 mL离心管中，加入Solution C 后颠倒混匀（注：Solution C 加入剂量和 Solution B剂量保持一致）。

3. 外泌体提取

（1) 加入外泌体提取液：在加入 Solution C 后的上清液中加入Solution D，具体加入剂量如下（其他剂量请根据表中的用量等比例换算）：

（2) 溶液混合：加入 Solution D 后将离心管盖紧，通过涡旋振荡器混匀 1 min，再放置于 4℃静置4h以上（注：增加静置时间可提高外泌体得率，但不可超过24h）；

（3) 沉淀外泌体：取出装有混合液的50 mL离心管于 4℃以 10,000 ×g 离心30 min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒（注：尽可能吸尽上清液）；

（4) 再次离心：将含有沉淀的离心管再次于 4℃以 3,000 ×g 离心5 min，弃上清（注：尽可能吸尽上清液）；

（5) 外泌体重悬：取合适量的 1×PBS 均匀吹打离心沉淀物，待其溶解后，将重悬液转移至新的 1.5 mL离心管中（建议每20 mL乳清用200 μL左右1×PBS重悬）；

（6) 收获外泌体颗粒：将含有重悬液的 1.5 mL离心管于4℃以 10,000 ×g 离心 2 min，保留上清液，其中富含外泌体颗粒（注：若沉淀较多，可10,000 ×g，2 min 离心多次至无明显沉淀，每次取上清液，外泌体溶液可能带有淡淡的乳白色，此为正常现象）。

注：外泌体的无菌处理：若需要无菌处理，可将外泌体用0.45μm滤器过滤后使用。

室温运输 ，2-8℃保存 ，直立放置，有效期 1 年。

Q：50 mL过滤柱是多大孔径的？

A：0.45 μm的孔径。