Blood Advanced Direct PCR Kit是一款可直接对全血样本进行PCR扩增而无需进行DNA纯化或样本预处理的试剂盒,兼容含EDTA、肝素、柠檬酸盐等常规抗凝剂的新鲜血液、冷藏(冻)血液及Whatman903®和FTA®商用干血渍。试剂盒中含有经过经基因工程改造的DNA Polymerase组合,具有保真性高、对PCR抑制剂耐受性强的特点,2× Hieff® Blood Advanced PCR Buffer中添加强力延伸因子、扩增增强因子以及优化的缓冲体系,能够在快速延伸条件下高效扩增8 kb的基因组片段,对于2 kb以下的片段,设置3-5 sec/kb延伸时间即可完成扩增,从而大幅缩短血液样本的鉴定及检测时间。
Hieff® Advanced High-Fidelity DNA Polymerase Mix的扩增产物的3’端为平末端,适用于一步法快速克隆及TOPO克隆试剂盒(Yeasen CAT# 10907/10908/10909/10910/10911/10912/10922)。
试剂盒中提供的引物预混液Positive control primer mix (10 μM each)能够从哺乳动物和大多数脊椎动物的sox21基因上游保守序列中扩增出长度237 bp的片段,可作为阳性对照使用。
- 扩增速度快
- GC兼容性高
- 模板耐受性强
- 物种适用性广
- 扩增长度高达8 kb
使用Blood Advanced Direct PCR Kit直接从人全血中扩增不同长度DNA片段。血样为-20℃储存的EDTA抗凝血,血液模板浓度为10%,延伸时间设置10 s/kb。M为10510ES60(Yeasen)。
- 延伸速度快
使用Blood Advanced Direct PCR Kit直接从人全血中扩增2 kb长度、GC含量71%的DNA片段。血样为-20℃储存的EDTA抗凝血,血液模板浓度为10%,延伸时间设置梯度1-10 s/kb,M为10510ES(Yeasen)。
- 物种适用性广
使用Positive control primer mix引物直接从不同物种、不同抗凝剂的全血及血卡中扩增237 bp的DNA片段。血液模板浓度为10%,血卡模板为1 mm2大小。NTC (no template control) 为DEPC水作为模板,PC (positive control)为提取纯化的人基因组DNA作为模板。M为10510ES60(Yeasen)。1.人EDTA抗疑血(-20°C);2.小鼠EDTA抗凝血(新鲜);3.山羊EDTA抗凝血(-80℃);4.人血卡;5.人肝素抗疑血(-80°C);6.鸡肝素抗凝血(新鲜);7.猪柠檬酸钠抗疑血(4°C);8.NTC (no template control);9.PC (positive control)。
- 耐受性强
图4A. 使用Blood Advanced Direct PCR Kit直接从人EDTA抗凝全血中扩增2 kb长度、GC含量71%的DNA片段。血液模板浓度设置梯度0.5-50%,延伸时间为10 s/kb。图4B. 使用Blood Advanced Direct PCR Kit直接从小鼠EDTA抗凝全血中扩增2.2 kb长度、GC含量67%的DNA片段。血液模板浓度设置0.5-50%,延伸时间为10s/kb。M为10510ES60(Yeasen)。
干冰运输。-20℃保存,有效期1年。
无扩增产物或产量少 | 产物呈现高分子量弥散条带 | 产物呈现低分子量弥散条带 |
检查引物设计,确认引物浓度和纯度 | 提高退火温度或设置退火梯度 | 电泳前离心取上清 |
重复实验,确认体系、程序无误 | 延伸时间不应过长 | 提高退火温度或设置退火梯度 |
增加循环数 | 尝试不同的血液用量 | 尝试不同的血液用量 |
优化退火温度 | 减少循环数 | 减少循环数 |
尝试不同的血液用量 | 降低引物浓度 | 降低引物浓度 |
重新设计引物 | 重新设计引物 |