病原NGS技术在动物疫病检测中的应用

动物传染病往往由多种病原体共同作用引起。以猪呼吸道疾病为例，猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪肺炎支原体等多种病毒和细菌常常同时感染，形成复杂的混合感染。传统单病原检测方法不仅耗时耗力，还难以全面反映感染的完整图景，易导致漏检。

与此同时，新型和变异病原体的不断出现也给检测带来巨大压力。例如，在牛呼吸道综合征的研究中，NGS技术成功揭示了牛鼻炎A病毒（BRAV）和D型流感病毒（IDV）等新型病毒，这些病原体在常规检测中很容易被遗漏。

传统动物疫病检测方法包括病原体分离培养、血清学检测和PCR等，各有其局限。病原体分离培养耗时长（数天至数周），且许多病原体难以在体外培养。血清学检测存在窗口期，无法区分既往感染与现症感染。PCR虽然灵敏度高、速度快，但一次只能检测有限数量的已知靶标，无法发现未知或变异病原体。动物疫病的病原体多样性、混合感染普遍性以及新发病原体的不断涌现，使得发展更高效、更全面的检测技术成为迫切需求。

mNGS是对样本中所有微生物的遗传物质进行无偏倚测序，无需事先预设检测目标。它可以一次性检测样本中的病毒、细菌、真菌、寄生虫等各类微生物，特别适用于未知病原体的发现和混合感染的全面分析。

在兽医领域，mNGS的应用涵盖动物及动物产品（动物源性食品、疫苗、饲料、生物材料等）中的各类微生物检测，包括病毒、细菌、真菌、寄生虫、放线菌、衣原体、支原体、立克次体和螺旋体等。2024年发布的国内首个《动物病原微生物宏基因组高通量测序技术规范专家共识（2024版）》，从实验室建设及管理、实验操作、生物信息学分析到结果判定等全流程给出了规范化指导，标志着mNGS在兽医领域的应用正从研究走向标准化。

在灵敏度方面，一项基于杂交捕获的测序研究表明，捕获法可将检测灵敏度大大提升，并在中高病毒载量样本中实现>99% 的基因组覆盖度，显著优于标准mNGS。

图1 NGS测序完整工作流程图（图片来源：网，侵删）

tNGS通过PCR扩增、探针杂交统等方式，对特定的基因组区域进行选择性富集后再进行测序。由于测序数据集中于目标区域，tNGS在保证高灵敏度的同时具有更高的成本效益。

扩增子建库的核心是多重PCR。它针对目标区域设计大量特异性引物对，在一次PCR反应中同时扩增多个目标片段。在动物疫病检测中，扩增子建库的优势在于操作流程简便、建库周期短，对微量样本也能实现高效扩增。其局限性主要体现在两方面：一是随着靶标数量的增加，引物间的干扰会加剧，扩增均一性难以控制，检测通量受限；二是对高GC含量区域、复杂序列以及基因融合等结构变异的检测能力有限。

杂交捕获建库则采取完全不同的策略。它不依赖引物扩增来获取目标，而是先对提取的核酸进行随机片段化、末端修复并连接测序接头，构建一个代表样本总核酸的全基因组文库。随后，将这个文库与生物素标记的寡核苷酸探针进行液相杂交，探针会与文库中互补的目标序列特异性结合。最后，利用链霉亲和素磁珠捕获这些探针-目标复合物，经清洗和二次扩增后，即获得高度富集的靶向测序文库。在动物疫病检测中，杂交捕获建库的核心优势在于能够一次性捕获数千甚至上万个靶标，非常适合开发覆盖病原体谱系极广的大型Panel，便于持续升级。主要挑战在于流程较长、手工操作步骤多，对DNA起始量要求较高，且单次建库的综合成本通常高于扩增子建库。