羟脯氨酸(Hyp)测定试剂盒 Hydroxyproline Assay Kit（60432ES）

本试剂盒测定原理如下：通过羟脯氨酸在氧化剂作用下产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛反应呈现紫红色，根据呈色深浅测定样本中羟脯氨酸含量。

该方法的优点包括快速简便，重复性强，适用于适用于血清、血浆、尿液、培养液及组织样本等的羟脯氨酸(Hyp)测定。

产品信息

组分信息

备注：

1）试剂一应用液的配制：临用时将粉剂一瓶，先加甲液10 mL 充分溶解（从瓶口向内看，完全溶解完）。然后再加乙液20 mL 充分混匀，配好后的试剂4℃～8℃保存。粉剂加甲液10 mL后一定要完全溶解后才能加乙液。

2）试剂三应用液的配制：临用时将粉剂一瓶加到30 mL溶剂中充分溶解，配好后2℃～8℃避光保存，1个月内有效。

3）100 µg/mL 标准贮备液的配制：测试前将一支标准品用双蒸水溶解后定容至50 mL，2℃～8℃保存2周内有效； 5 µg/mL标准应用液的配制：取100 µg/mL标准贮备液1mL 加双蒸水定容至20 mL，现用现配。

使用说明

1.仪器试剂准备

含550 nm波长的分光光度计、1 cm光径比色皿（或酶标仪及96孔板）、60℃及100℃水浴锅、台式低速离心机、各种规格移液器、双蒸水、生理盐水（0.9%）或PBS（0.1M）、涡旋混匀器、试管或离心管。

2.样本前处理

1）血清/浆

取0.5 mL血清/浆准确加水解液1 mL，混匀。放试管中加盖后，95℃或者沸水浴水解20分钟。

2）尿液/培养液

取1.0 mL 尿液/培养液准确加水解液1 mL，混匀。放试管中加盖后，95℃或者沸水浴水解20分钟。

3）组织

精确称取组织湿重30～100 mg 放入试管中，准确加水解液1 mL，混匀。加盖后95℃或者沸水浴水解20分钟（水解10分钟时混匀一次，目的是使水解更充分）。

3.调pH值至6.0～6.8左右

1）将各试管流水冷却后各管加指示剂10 μL，摇匀；

2）各管准确加入调pH甲液1.0mL，混匀（此时溶液应为红色，若未变为红色，请补加甲液直至溶液为红色）；

3）用200 μL的加样器吸取调pH乙液向各管内逐滴小心加入，每滴加入后均要混匀，直至液体中指示剂的颜色变成黄绿色（约加入调pH乙液100 μL～500 μL左右）；

【注】：加调pH乙液时，每加一滴均要混匀，为防止液体外溢，如果没有带盖的玻璃磨口试管，可用普通玻璃试管代替，每次混匀时可用塑料薄膜或冰箱保鲜膜压住试管口，充分旋涡混匀即可。若样本是细胞培养液，因其中含有酚红，所以液体

中的混合指示剂在pH 为 6.0～6.8 左右时为橙黄红色，而不是黄绿色。

4）然后加双蒸水至10 mL，混匀；

5）取3～4 mL稀释的水解液加适量活性炭（约20～30 mg左右，以上清液离心后澄清无色为准），混匀，3500转/分，离心10分钟，小心取上清1 mL作检测。

4.操作表

参考取样量： 样本碱水解法的参考取样量：皮肤组织湿重0.03～0.05 g，软骨湿重0.08～0.1 g，肝组织湿重0.08～0.1 g，细胞培养液0.5 mL，血清/浆0.5 mL。

5.计算公式

1）血清/浆或尿液的计算：

羟脯氨酸含量(μg/mL) = (A测定-A空白)/(A标准-A空白) × C标准 × V水解液/V样

其中，C标准：表示标准液浓度，5 μg/mL；V水解液：表示水解液总体积，10 mL；V样：样本取样量，血清/浆 0.5 mL，尿液1 mL。

2）组织的计算：

羟脯氨酸含量(μg/mg组织) = (A测定-A空白)/(A标准-A空白) × C标准 × V水解液/W

其中，C标准：表示标准液浓度，5 μg/mL；V水解液：表示水解液总体积，10 mL；W：表示组织质量，mg。

2～8℃保存，有效期6个月。