α-Ketoglutarate（α-酮戊二酸）是克雷布斯循环中的关键分子，其决定了生物体的柠檬酸循环的总体速率。作为谷氨酸和谷氨酰胺的前体，α-酮戊二酸也是胃肠道细胞的代谢燃料，它可以降低蛋白质分解代谢并增加蛋白质合成，从而增强骨骼肌中的骨组织形成，并可用于临床应用。α-酮戊二酸可用于肾脏疾病、肠道和胃部疾病，包括细菌感染、肝脏问题、白内障和反复发酵的酵母菌感染，它还可用于接受血液透析的肾病患者处理蛋白质的方式。

翌圣生物提供的α-Ketoglutarate Fluorimetric Detection Assay Kit（Red Fluorescence）α-酮戊二酸荧光检测试剂盒(红色荧光)提供灵敏的荧光测定，用于定量生物样品中的α-酮戊二酸。它利用酶偶联反应释放过氧化氢，可通过Amplite Red在Ex/Em为540/590 nm处读取其信号，建议使用纯黑色的孔板。

组分信息

使用说明

1.溶液制备

1.1储备溶液

建议将未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-25~-15℃的条件下，避免反复冻融循环。

Amplite Red储备液（200X）：将50 μL DMSO（组分E）加入到 Amplite Red（组分A）的小瓶中，制备成200X的 Amplite Red储备液。

1.2标准溶液

α-酮戊二酸标准溶液的制备： 将10 μL10 mM的α-酮戊二酸标准品（组分D）加入990 μL PBS（41403ES PBS）中，得到100 μM的α-酮戊二酸标准溶液（AKG7）。然后按照1：2比例依次稀释以获得其他浓度的α-酮戊二酸标准品（AKG6-AKG1）。【浓度信息为：AKG6：33.3333 μM；AKG5：11.1111 μM；AKG4：3.7037 μM；AKG3：1.23460 μM；AKG2：0.4115 μM；AKG1： 0.1372 μM】。

1.3工作溶液

1）将5 mL测定缓冲液（组分C）加入一个酶混合物1瓶（组分B1）中并充分混合。

_{2）将100 μL ddH2O加入一个酶混合物2瓶（组分B2）中并充分混合。}

3）将整个小瓶（100 μL）的酶混合物2和25 μL的200X Amplite Red 储备溶液转移到小瓶混合物1

的小瓶中并充分混合以制备α-酮戊二酸的工作溶液。【注意：对于一个板，5 mL的α-酮戊二酸工作溶液工作溶液已足够，且反应混合物不稳定，请及时使用。】

2.样品分析

2.1根据表1和表2中提供的布局，加入α-酮戊二酸标准品（AKG），空白对照（BL）和 测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25 μL试剂代替50 μL。

2.2向α-酮戊二酸标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入50 μL α-酮戊二酸工作溶液，使总α-酮戊二酸测定体积为100 μL/孔。对于384孔板，在每个孔中加入25 μL α-酮戊二酸工作溶液，总体积为50 μL/孔。

2.3将反应混合物在37℃孵育30-60分钟。

2.4荧光酶标仪下测量荧光数值，Ex/Em=540/590 nm。

表1实心黑色96孔微孔板中的α-酮戊二酸标准品和测试样品的布局[AKG=α-酮戊二酸标准品(AKG1-AKG7,0.1372至100 μM）；BL=空白对照；TS=测试样品]

表2 每个孔的试剂组成

3.实验方案概述

3.1在开始实验之前，将所有试剂盒组件解冻至室温。

3.2准备测试样品和连续稀释的α-酮戊二酸标准品（50 μL）。

3.3加入等体积的α-酮戊二酸工作液（50 μL）。

3.4在37°C孵育30-60分钟。

3.5监测Ex/Em=540/590 nm处的荧光增加。

-25~-15℃避光保存，有效期12个月。